人表皮生長因子受體結構域蛋白的原核表達、純化及活性檢測

郭靖 ，王濤，李齊宏，李玲，梁迎春，洪甜，梅國徽，冀全博，紀貝貝，徐小潔，葉棋濃

1.大連醫科大學 腫瘤干細胞研究院，遼寧 大連 116044；2.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100850；3.軍事醫學科學院 附屬醫院，北京 100071

表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）是Ⅰ型受體酪氨酸激酶家族成員[1]。EGFR 是一種跨膜糖蛋白、細胞膜受體，其基因位于人類第7 號染色體短臂上。EGFR 由1186 個氨基酸殘基構成，相對分子質量為170×103，由胞外區、胞內配體結合區、跨膜區三部分組成[2]。胞外區包含L-1/2兩個富含亮氨酸序列和CR-1/2兩個富含半胱氨酸序列，是621 個氨基酸殘基構成的與配體結合的N端區；跨膜區是23個氨基酸殘基構成的α螺旋；胞內區由近膜區（juxtam embrane region，JM）、酪氨酸蛋白激酶區和C 端構成，含有542 個氨基酸殘基。受其相應配體誘導激活之后，EGFR 可參與細胞信號通路，通過不同的受體類型和磷酸化結合位點，激活不同的信號蛋白，參與細胞分化、增殖、遷移、侵襲和損傷修復[3]。因此，EGFR 發揮生物學效應依賴于其胞外區和胞內激酶區的完整性及穩定性。

為了進一步探索EGFR 在腫瘤發生發展中的具體功能，我們將EGFR 的胞外結構域（extracellular domain，ED）和胞內激酶結構域（protein kinase domain，PKD）分別構建在原核表達載體上，表達獲得融合蛋白GST-EGFR-ED 和GST-EGFR-PKD，為深入研究EGFR在腫瘤中的作用奠定了實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、Rossate，原核表達載體pGEXKG 為本室保存；DNA 膠回收試劑盒、PCR 產物回收試劑盒為北京天根生物科技有限公司產品；XbaⅠ和XhoⅠ限制性核酸內切酶、Prime STAR HS DNA 聚合酶、T4DNA 連接酶為TaKaRa 公司產品；質粒提取試劑盒為Promega 公司產品；GST-Sepharose 4B 珠子購自Pharmacia 公司；DMEM 及小牛血清均購自Gibco 公司；VigoFect 為威格拉斯生物技術有限公司產品；辣根過氧化物酶偶聯的抗GST、Flag 單克隆抗體購自Sigma 公司；引物由北京賽百盛生物技術有限公司合成；測序由北京奧科生物技術公司完成。

1.2 人EGFR ED、PKD編碼基因的擴增

分別設計人EGFR ED 和PKD 基因擴增引物序列（表1），上、下游引物分別含XbaⅠ和XhoⅠ酶切位點。以人乳腺文庫為模板，用Prime STAR HS DNA聚合酶PCR 擴增目的片段。擴增條件：95℃5 min預變性；95℃30 s、58℃30 s、72℃130 s，32 個循環；72℃延伸50 s。擴增產物以1.5%瓊脂糖DNA 膠檢測，用瓊脂糖DNA膠回收試劑盒回收。

1.3 重組表達質粒的構建及原核表達鑒定

EGFR ED 和PKD 膠回收產物用XbaⅠ、XhoⅠ雙酶切，載體pGEX-KG也經相同酶雙酶切膠回收載體大片段；酶切產物經T4DNA 連接酶于16℃連接4 h 后，轉化大腸桿菌DH5α，涂LB（含氨芐西林）平板，37℃培養過夜；挑選單克隆，做菌液PCR，再挑選陽性克隆，接種于LB（含氨芐西林）培養基中，37℃振蕩活化14 h；提取質粒進行雙酶切鑒定，正確質粒送北京奧科生物技術公司測序。

1.4 融合蛋白的小量誘導表達及鑒定

將測序正確的重組表達質粒轉化大腸桿菌Rossate 感受態細胞，挑取單個菌落，37℃振蕩培養至D600nm為0.6～1.0，加入IPTG 至終濃度1 mmol/L，誘導4 h后收集菌液離心，菌體行Western印跡檢測。

1.5 融合蛋白的純化

將小量誘導表達的重組Rossate 菌和含有pGEX-KG 空載體的Rossate 菌接種于LB（含氨芐西林）培養基中，37℃振蕩活化過夜；按10%的比例轉接同種液體培養基中，29℃振蕩培養至D600nm為0.4～0.6時加入IPTG 至終濃度0.1 mmol/L，19℃繼續培養20～24 h；離心收集菌體，按Pharmacia 公司提供的純化方法行蛋白純化：加入裂解液，超聲波破碎菌體，12 000 r/min 離心收集上清，加入適量GST-Sepharose 4B珠子，4℃旋轉結合3 h，3000 r/min低速離心收集珠子，緩沖液充分洗脫未結合蛋白質，以Western印跡鑒定純化的蛋白，作為誘餌蛋白。

2 結果

2.1 人EGFR ED、PKD編碼區基因的克隆

以人乳腺文庫為模板，按前述條件分別擴增EGFR ED 和PKD 編碼序列，獲得的ED 片段大小為582 bp，PKD為811 bp，與預期一致（圖1）。

2.2 重組表達載體pGEX-GST-EGFR-ED、pGEXGST-EGFR-PKD 的構建與鑒定

用Xba Ⅰ和XhoⅠ雙酶切EGFR ED、PKD 的PCR 產物，分別與經同樣酶切的pGEX-KG 載體連接，2種連接產物均轉化大腸桿菌DH5α，涂布LB（含氨芐西林）平皿，挑取克隆提質粒進行酶切鑒定，得到與預期片段大小相符的外源基因插入片段，對照空載體雙酶切后無此片段，表明EGFR ED、PKD 基因的編碼序列已正確插入載體上游的多克隆位點中。DNA 測序結果顯示，插入表達載體pGEX-KG中的EGFR ED 和PKD 編碼序列完整，方向正確，無突變發生（數據略）。見圖2、3。

2.3 融合蛋白GST-EGFR-EDG 和GST-EGFRPKD的誘導表達及鑒定

圖1 目的基因的PCR擴增

將pGEX-KG 空載體、pGEX-EGFR-ED 和pGEX-EGFR-PKD 融合表達質粒分別轉化大腸桿菌Rossate 感受態細胞，經IPTG 小量誘導后，Western 印跡檢測，GST-EGFR-ED 和GST-EGFR-PKD 融合蛋白獲得正確表達（圖4）。

2.4 融合蛋白GST-EGFR-ED、GST-EGFR-PKD 的純化

利用GST-Sepharose 4B 親和珠子純化獲得融合蛋白，考馬斯亮藍染色檢測結果顯示獲得一定量的純度較高的GST、GST-EGFR-ED 和GST-EGFRPKD融合蛋白（圖5）。

2.5 GST pull-down分析

圖2 重組質粒pGEX-GST-EGFR-ED 和pGEX-GST-EGFR-PKD 的菌液PCR電泳結果

圖3 重組質粒的雙酶切鑒定

圖4 融合蛋白的Western印跡分析

為進一步研究純化的GST-EGFR-ED 和GSTEGFR-PKD 能否與Memo（mediator of ErbB2-driven cell motility）蛋白相互作用，將帶有GST-EGFRED 和GST-EGFR-PKD 的純化珠子與過表達Myc-Her2 的293T 細胞裂解液于4℃結合后，用Myc-Her2抗體行Western 印跡檢測。結果顯示，GST-EGFRPKD 可與Myc-Her2 結合，在符合Myc-Her2 大小的相對分子質量約180×103位置顯示出特異性條帶（圖6），而GST 載體蛋白及GST-EGFR-ED 在同一位置無此條帶，說明GST-EGFR-PKD 能夠與Myc-Her2特異地相互作用，GST 標簽并不影響蛋白的結構及生物學功能。

3 討論

細胞表面EGFR 的表達是其下游信號轉導通路激活的基礎，也是原癌基因的表達產物[4]。EGFR 在多種腫瘤中高表達，可促進血管生成及腫瘤細胞的增殖、黏附、侵襲和轉移，抑制腫瘤細胞的凋亡[5-7]。并且，EGFR 過度表達的細胞表現出對促凋亡藥的抵抗性[8]。另外，EGFR 直接參與腫瘤發生、發展過程[9]。EGFR 的活化需要經過3 個過程[10]：①EGFR 與配體結合后導致受體形成同源二聚體，也可與其他EGFR 家族成員形成異源二聚體；②形成的二聚體促使EGFR 胞內區6 個特異的受體酪氨酸殘基磷酸化，分別將外界各種信號轉導至胞內；③當細胞核接收到信號傳導后，核內的基因轉錄水平增加，EGFR的表達增加。

圖5 純化的GST-EGFR-ED、GST-EGFR-PKD 融合蛋白SDS-PAGE分析

圖6 GST pull-down檢測目的蛋白與Myc-Her2蛋白的相互作用

Her2 過表達引起Ras/MAPK、PI3K/Akt 等信號通路的一系列反應[11-12]。王瓊等證明Her2 和EGFR正相關，并推測兩者可能在腫瘤的發生和轉移等方面存在協同作用[13]。同時，Ling等證明EGFR和Her2之間存在相互作用[14]。本實驗構建了EGFR 不同區域的原核表達載體，并與Her2 進行了GST pulldown 實驗，結果顯示Her2 結合在EGFR 胞內激酶區，而不與EGFR 胞外區結合。這可以解釋Her2 與EGFR 正相關并能協同影響信號通路的現象，為進一步研究兩者的功能提供了另一條途徑。

EGFR 是具有良好前景的腫瘤診斷和治療靶點。阻斷EGFR 表達的靶向抑制劑能夠增加腫瘤細胞的放射敏感性，提高放射治療的療效，其機制可能是EGFR 的靶向抑制劑抑制了腫瘤細胞的EGFR 表達，阻斷了EGFR 信號傳導通路，從而加速細胞凋亡，干擾細胞周期分布及細胞輻射后DNA 損傷的修復[15]。但是，EGFR 在腫瘤發生、發展及預后等方面中的具體作用機制還有待探究。我們克隆了GSTEGFR-ED 和GST-EGFR-PKD 基因并獲得其原核表達融合蛋白，為后續進一步研究其在腫瘤發生發展、蛋白相互作用及抗體制備等方面的作用奠定了實驗學基礎。

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