血小板衍生生長因子BB亞型在畢赤酵母中的表達及純化

房婷 ，張曉鵬，章晟，戴萌萌，楊秀旭，付玲，于長明

1.軍事醫學科學院科學院 生物工程研究所，北京 100071；2.北京軍區總醫院 附屬八一兒童醫院，北京 100700

血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是一種耐熱、耐酸及易被胰蛋白酶水解的陽離子糖蛋白，主要由成熟的血小板分泌，1974年由Ross 等首先從血小板中獲得[1]。PDGF 作為一種有絲分裂促進劑，可以刺激成纖維細胞和平滑肌細胞的分裂和趨化功能、促進巨噬細胞產生和分泌生長因子，在胚胎發生、創傷愈合、動脈硬化及惡性腫瘤等體內多個病理、生理過程中均發揮重要作用，尤其在創傷愈合方面作用更為顯著[2-8]。PDGF 是陽離子糖蛋白，相對分子質量為28×103～35×103，等電點為9.8，由A、B 兩條肽鏈通過二硫鍵構成同型或異型的二聚體[9]。PDGF 家族有5 個亞型，即PDGF-A（AA）、PDGF-B（AB 和BB）、PDGF-C（CC）和PDGFD（DD）[10]；5 個亞型通過2 種特異性受體（PDGF receptor，PDGFR）α和β調節多種細胞功能[11]。

重組人PDGF-BB（rhPDGF-BB）的相關研究展現出良好的臨床應用前景，受到廣泛關注[12]。1997年美國FDA 批準Regranex 上市，用于慢性糖尿病引發的神經性潰瘍的治療，其活性成分就是釀酒酵母表達的0.01%的rhPDGF-BB。N 端氨基酸分析表明，從人血小板提取物中分離純化的PDGF-BB 存在3 種不同的剪切形式，即20%的Ser1、45%的Thr6 及35%的Thr33，這些切割的異質性導致PDGF 的不均一性[13]。釀酒酵母表達的109 個氨基酸的重組PDGF-BB，N 端氨基酸序列同樣存在2 種形式，即109 個氨基酸的全長B 鏈和104 個氨基酸的缺失B鏈Thr6-PDGF-BB，使得PDGF-BB 的精確質量控制較困難，而且104個氨基酸的B 鏈蛋白保持與109個氨基酸同樣的生物學活性[14]。

在本研究中，我們采用巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統，構建了104個氨基酸的PDGF-BB基因，并進行了高密度發酵培養，利用三步層析對發酵上清進行純化，并對蛋白進行初步鑒定和生物學活性測定，獲得了適于畢赤酵母表達系統的、適度糖基化且純度和生物學活性符合要求的rhPDGF-BB。

1 材料與方法

1.1 材料

人早幼粒白血病細胞系HL-60 細胞為本室保存；BALB/c 小鼠3T3 細胞株購自中國藥品生物制品檢定所；畢赤酵母GS115、大腸桿菌DH5α由本室保存；pMEX9K由本實驗室構建并保存。

限制性內切酶、T4DNA 連接酶購自Promega 公司；TRIzol 總RNA 提取試劑盒為Gibco 公司產品；低分子量蛋白標準購自Sigma 公司；YNB 為Difico 公司產品；PDGF-BB 國際標準品IS94/728 購自英國國家生物制品檢定所（NIBSC）；PVDF 膜為Millipore 公司產品；PDGF-B（F-3）抗體為Santa Cruz Biotechnology 公司產品；二抗Anti-mouse IgG、HRP-linked Antibody 為Cell Signaling Technology 公司產品；層析介質Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（High Sub）、Source 30S、Superdex 75 prep grade 購 自GE Healthcare公司。

1.2 目的基因的獲得

采用TRIzol 試劑盒從人早幼粒白血病細胞系HL-60 細胞中提取總RNA。以提取的RNA 為模板進行RT-PCR，正向引物為5'-CCGCTCGAG（XhoⅠ）AAAAGAACCATTGCTGAGCCGGCCA-3'，反向引物為5'-GGAATTC（EcoRⅠ）TTAGGTCACAGGCCGT-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

50 μL 反應體系：AMV/Tf15×緩沖液10 μL，dNTP 1 mmol/L，MgSO4（50 mmol/L）1 μL，上、下游引物各50 pmol，AMV 逆轉錄酶5 U，Tf1DNA 聚合酶5 U，總RNA 50 ng。反應條件：48℃逆轉錄45 min，94℃滅活逆轉錄酶2 min，然后以94℃變性30 s、60℃復性30 s、72℃延伸40 s進行35個循環，最后72℃總延伸7 min?；厥誔CR 產物。

1.3 表達載體的構建

將回收獲得的目的基因片段與分泌型酵母表達載體pMEX9K 片段按照分子摩爾比＞3∶1 的比例構建連接體系，用T4DNA 連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態菌株，隨機挑取若干轉化后的克隆進行菌類PCR 鑒定，鑒定為陽性的克隆提取質粒后委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.4 電轉化重組質粒DNA至酵母感受態細胞

將鑒定為陽性的pMEX9k-PDGF-B 克隆接種至LB（含氨芐西林）培養基中，37℃、220 r/min 振蕩培養過夜，次日提取重組質粒，用SalⅠ-HF 酶線性化，電轉化至酵母菌株GS115 中，轉化產物涂布MD 平板，篩選得到his+重組克隆，隨機挑取若干重組克隆進行菌類PCR 鑒定，鑒定為陽性的克隆提取質粒后委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.5 高表達菌株的篩選

由于pMEX9K 載體具有G418 抗性，因此取his+重組克隆涂布在不同G418濃度的YPD平板上，用于篩選多拷貝插入子。分別取200 μL 細胞懸液涂于平板上，G418 終濃度為0.25、0.5、1.0 和2.0 mg/mL，30℃培養2～3 d，篩選具有高G418抗性、且生長良好的菌株作為表達菌株。分別挑取單克隆接種于5 mL BMGY 培養基中，30℃、250 r/min 振蕩培養過夜，室溫3000 r/min離心5 min，棄上清，用BMMY重懸菌體，30℃、250 r/min 振蕩誘導表達，每24 h 補加甲醇至0.5%，誘導72 h 后，室溫8000 r/min 離心20 min 收集上清。非還原SDS-PAGE 檢測各克隆表達情況，選取目的蛋白（相對分子質量約30×103條帶）表達量高的菌株，測定表達上清的蛋白濃度（Lowrry法，見2010 年版《中華人民共和國藥典》（三部）附錄ⅥB 第二法），并對非還原SDS-PAGE 的結果掃描進行灰度分析。

1.6 重組蛋白的誘導表達

用BMGY/BMMY培養基誘導蛋白表達。挑取新鮮平板上單菌落到裝有25 mL BMGY 培養基的250 mL 搖瓶中，28～30℃、250 r/min 振蕩培養至D600nm為2～6（16～18 h）。將25 mL 過夜培養物接種至含1 L BMGY 培養基的5 L 搖瓶中，28～30℃、250 r/min 繼續培養至對數生長期（D600nm為2～6）,離心收集菌體。去除原培養基，用1 L BMMY 培養基重懸酵母細胞，28℃、250 r/min 開始誘導表達，每隔24 h 添加甲醇至終濃度為0.5%，誘導表達72 h 后，8000 r/min離心20 min，收集酵母表達上清。

1.7 重組蛋白的純化

1.7.1 Phenyl HS 疏水層析 表達上清用1/2 體積的調節緩沖液［60 mmol/L PB，3 mol/L（NH4）2SO4，pH7.2］調節電導，8000 r/min 離心20 min，上樣于用20 mmol/L PB、1 mol/L（NH4）2SO4（pH7.2）溶液平衡好的Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（High Sub）疏水層析柱，上樣結束后，用20 mmol/L PB、1 mol/L（NH4）2SO4（pH7.2）的溶液再平衡，重組蛋白用洗脫液（20 mmol/L PB，50%乙二醇，pH7.2）洗脫，收集目的蛋白峰。

1.7.2 Source 30S 離子層析 用平衡緩沖液（20 mmol/L PB，pH7.2）稀釋Phenyl HS 洗脫峰至電導值為6 ms/cm 以下，直接上樣于用平衡緩沖液平衡好的Source 30S離子層析柱，用20 mmol/L PB、1 mol/L NaCl（pH7.2）梯度洗脫，收集目的蛋白。

1.7.3 Superdex 75 凝膠層析 目的蛋白峰用0.45 μm 孔徑的濾膜過濾后，用Superloop 分次上樣，每次上樣體積不超過柱體積的3%。采用Hiload Superdex 75 pg 凝膠濾裝柱，平衡液為20 mmol/L PB、0.15 mol/L NaCl（pH7.2），一步法收集洗脫峰。

1.8 重組蛋白的鑒定和活性測定

將純化的rhPDGF-BB 進行還原及非還原SDSPAGE，分離膠濃度為15%，上樣量分別為10 和2 μg。Western 印跡條件：15% SDS-PAGE，電轉條件為300 mA 穩流1 h，將蛋白轉到PVDF 膜上，抗PDGF-B 的一抗按1∶1000 稀釋，二抗按1∶10000 用封閉液稀釋。采用Edman 化學降解法測定N 端前5個氨基酸序列。

采用BALB/c 小鼠3T3 細胞株/MTT 法測定純化后的rhPDGF-BB 生物活性。具體方法如下：取對數生長期的BALB/C 3T3 細胞，計數后以測定培養液調整細胞密度至1×105/mL，接種于96 孔細胞培養板，每孔100 μL，37℃、5% CO2條件下培養18～24 h。取PDGF-BB 國際標準品，以無血清DMEM 培養液溶解并稀釋至40 U/mL，同法稀釋待測樣品，將已預稀釋的參考品和待測樣品于96 孔板上用無血清DMEM 培養液進行倍比梯度稀釋，共做12 梯度濃度，每一梯度設2 個復孔；將梯度稀釋好的參考品和待測樣品每孔加入100 μL至已接種BALB/c 3T3細胞的96 孔細胞培養板中，37℃、5% CO2條件下培養64～72 h。加入MTT 溶液，培養5 h 后加入DMSO 裂解液，室溫放置30 min 后比色，測定D510nm值，計算rhPDGF-BB的生物活性。

實驗數據采用四參數回歸計算法進行處理。

2 結果

2.1 目的基因的獲得和酵母表達株的構建

RT-PCR 一步法獲得目的基因312 bp，命名為PGBF-BB，經10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳分析，目的條帶大小正確（圖1），與本室保存的pMEX9K 載體[14]連接構建pMEX9K-PGBF-B 表達連接載體。pMEX9K由畢赤酵母蛋白表達專用載體pPIC9K 改構而來，通過AXO1（alochol oxidase，乙醇氧化酶）啟動子調控外源蛋白的表達，并且有由α交配因子（α-factor）分泌的信號序列引導外源蛋白分泌表達。鑒定為陽性的表達載體經SalⅠ酶線性化后電轉化受體菌GS115，得到his+重組克隆。PCR 法鑒定重組克隆，檢測引物為5'AXO1引物和3'AXO1引物，結果（圖2）為2 條帶，一條為約2.2 kb 的野生型AXO1基因，另一條為789 bp 的含目的基因的片段，其中目的基因312 bp，AXO1基因側翼序列長480 bp。

2.2 高表達株的篩選

pMEX9K載體賦予重組克隆對G418的抗性，而這種抗性的水平與整合入酵母基因組中載體的拷貝數呈正相關[15]。經過4 輪篩選，最終在含有2.0 mg/mL G418 的YPD 平板上篩選到6 個克隆，將重組克隆進行誘導表達，15% SDS-PAGE 顯示（圖3）發酵上清中主要為目的蛋白條帶，可見重組蛋白為分泌表達；2.0 mg/mL G418 平板的重組克隆經誘導后重組蛋白的表達量最高，振蕩培養后加甘油凍存作為發酵用種子。

2.3 重組蛋白的誘導表達

圖1 RT-PCR擴增PDGF-BB基因

圖2 菌落PCR結果

畢赤酵母是甲醇營養型酵母，可利用甲醇作為其惟一碳源。在代謝甲醇的過程中，由于相關酶的結合效率低，使得畢赤酵母代償性地產生大量的酶，而調控該酶的啟動子也正是驅動外源基因在畢赤酵母中表達的啟動子。因此，通過BMGY 培養基增菌過程及更換BMMY 培養基誘導蛋白表達，在每個時間點取樣，SDS-PAGE 分析目的蛋白在發酵上清中的表達情況，結果見圖4。隨著誘導時間的增加表達量逐漸升高，48 和72 h 差異不明顯，72 h 時表達量最高，且很據蛋白濃度測定和BandScan 灰度掃描結果計算，目的蛋白的表達量高于100 μg/mL。

2.4 PDGF-BB的純化

發酵上清調節電導后先經Phenyl HS 捕獲，通過一步洗脫將目的蛋白有效富集，同時去除了大部分發酵培養基中的色素和其他雜蛋白（圖5）；第二步為Source 30S，此步基于目的蛋白與雜蛋白離子性質的不同，同時由于該填料粒徑較小、分布均勻具有很高的分辨率，通過進一步的梯度洗脫可將絕大部分雜蛋白和剩余色素去除，同時將目的蛋白進一步富集濃縮（圖6）；最后通過Superdex 75 凝膠過濾柱進行精細純化，去除痕量雜質并完成緩沖液置換（圖7）。

2.5 PDGF-BB的鑒定和活性測定

圖3 高拷貝篩選后蛋白表達水平結果

圖4 PDGF-BB不同誘導時間的SDS-PAGD圖

非還原及還原SDS-PAGE 結果（圖8A）掃描后經BandScan 5.0 軟件分析顯示，獲得的目的蛋白為同源二聚體形式，純度大于95%，單體形式表觀相對分子質量約為14.5×103。Western 印跡結果（圖8B）表明目的蛋白能特異地與一抗結合，而陰性對照菌株和未經誘導表達菌株的發酵上清均無陽性條帶。N 端測序結果見圖9，前5 個氨基酸殘基為T-I-AE-P，與理論一致，說明該重組蛋白N 端加工正確，未發生不正確剪切。Lowrry 法測定的PDGF-BB 濃度為3.21 mg/mL，采用BALB/c 3T3 細胞株/MTT 法測定的純化后目的蛋白的活性為1.61×106IU/mL，比活為5.0×105IU/mg（圖10）。

圖5 Phenyl HS層析結果圖

圖6 Source 30S層析結果圖

3 討論

畢赤酵母表達系統是20 世紀80～90 年代發展起來的極具潛力的酵母表達系統[17]，利用該系統已成功表達了幾百種酶、藥用和疫苗用蛋白[18]。該系統具有許多其他蛋白表達系統所不具備的優點，如可進行高密度發酵培養，培養基成分簡單、廉價、適于工業化生產，外源基因不易丟失，表達量高，許多蛋白甚至可達每升克級以上[19]，作為真核表達系統，可對表達的蛋白進行翻譯后正確加工和修飾，即二硫鍵的形成、蛋白的磷酸化、折疊、信號序列的加工和糖基化，而且不會像釀酒酵母產生超糖基化[20]。PDGF 已在多種系統中成功表達，如大腸桿菌[21]、釀酒酵母[14]、CHO 真核細胞[22]等，但具有如大腸桿菌表達為包含體、需要復性；釀酒酵母表達量低、難以量產；CHO系統成本高昂、生產周期長等缺點。

圖7 Superdex 75層析結果圖

圖8 PDGF-BB蛋白SDS-PAGE（A）和Western印跡（B）分析

我們用畢赤酵母系統以分泌形式表達rhPDGFBB，表達量可達每升百克級別，而且目的蛋白直接分泌到培養基中，不需復雜的破菌過程，且上清中雜蛋白含量很低，便于分離純化。通過三步實現了重組蛋白的高效純化，獲得了N 端整齊均一、純度和活性都符合要求的rhPDGF-BB 蛋白。綜上，我們利用畢赤酵母表達系統表達重組人PDGF-BB，表達產量高，成本低，工藝簡單，易于工業化放大，有良好的市場前景。

圖9 PDGF-BB蛋白N端測序結果

圖10 PDGF-BB蛋白的MTT法活性測定結果

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