miR-155 對人肝癌細胞系SK-HEP-1 及MHCC-97H 增殖與浸潤能力的影響

傅春江 ，毛廷森，曾泉，陳琳，周軍年，賈雅麗，岳文

1.房山區中醫院，北京 102400；2.軍事醫學科學院 野戰輸血研究所，全軍干細胞與再生醫學重點研究室，北京 100850

小干擾RNA（miRNA）在腫瘤的發生發展中扮演的角色近年來成為腫瘤研究領域的熱點，并取得一系列突破性進展。miRNA 被證明在機體的正常發育過程中，以及包括腫瘤在內的疾病發生發展中發揮重要作用[1-2]。研究表明，miRNA 參與干細胞的干性維持以及向成熟細胞的定向分化過程，對上皮間質轉化過程具有調控作用，并通過不同的信號通路調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲及轉移，與腫瘤的發生、發展及預后密切相關[3-5]。值得關注的是，多種miRNA 被發現在肝癌中異常表達，并對肝癌細胞的生物學行為產生影響，從而在肝癌的發生發展中發揮重要作用。對這些miRNA 的深入研究，將有望為發現新的肝腫瘤標志物及新的診療靶標提供理論基礎[6-7]。

原發性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國最常見的惡性腫瘤之一，居我國癌癥死亡原因第2 位，在全世界范圍內為發病率最高的第五大惡性腫瘤，其死亡率在惡性腫瘤死亡順位中居第3 位。肝細胞癌的發生發展是一個多步驟、多因素的復雜過程，涉及眾多生長因子、癌基因和抑癌基因的異常表達或激活，乙肝病毒和丙肝病毒所導致的癌變，酒精所致的肝損傷等[8-10]。除此之外，近年越來越多的研究表明，腫瘤微環境在肝癌的演進過程中有不容忽視的重要作用[11-12]。肝癌微環境由多種基質細胞組成，包括間充質干細胞、肝星狀細胞、內皮細胞、成纖維細胞、肌成纖維細胞、脂肪細胞、巨噬細胞、炎癥細胞等，它們能夠分泌大量的生長因子、細胞因子、基質金屬降解酶等，參與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移及耐藥[13-14]。我們的前期工作發現，腫瘤微環境中間質細胞呈激活狀態并高表達EPM、S-100A4 等因子，繼而引起腫瘤細胞系列基因表達的改變及生物學行為的改變[15]。我們系統地對間質細胞引起的MHCC-97H 等肝癌細胞中miRNA 表達的改變進行篩選與分析，發現腫瘤細胞的miR-155在間質細胞的刺激下明顯表達上調。本實驗中，我們通過在肝癌細胞系SK-HEP-1 及MHCC-97H 中過表達miR-155，研究其對肝腫瘤細胞增殖與浸潤等生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞系SK-HEP-1 及MHCC-97H 由本室保存；pcDNA3.0-miR-155真核表達載體由軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所鄭曉飛教授饋贈；限制性內切酶、核酸分子量標記等購自寶生物公司；引物合成由上海英駿公司完成；反轉錄試劑盒及實時定量用SYBR Green 染料購自QIAGEN 公司；CCK8購自日本同仁株式會社；高糖培養基購自Gibco 公司；胎牛血清購自Hyclone 公司；TRIzol 及LipofectAMINE 2000試劑購自Invitrogen公司。

1.2 細胞培養與轉染

將SK-HEP-1 及MHCC-97H 細胞接種于6 孔板中，用含10%胎牛血清的高糖培養基，于37℃、5%CO2條件下培養。采用LipofectAMINE 2000 轉染細胞，每孔加入溶解于opti-MEM 的10 μL LipofectAMINE 2000 和4 μg pcDNA3.0-miR-155 質粒DNA，對照組加入與實驗組等量的LipofectAMINE 2000和pcDNA3.0質粒DNA。轉染第2 d換液，72 h后收獲轉染細胞用于miRNA的實時定量PCR檢測。

1.3 實時定量PCR 檢測miR-155 在細胞中的表達水平

用QIAGEN 公司的miScriptⅡRT 試劑盒進行RNA 反轉錄得到cDNA 后，采用SYBR Green 法實時定量PCR 檢測，上游引物為5'-TTAATGCCTAATC GTGATAGGGGTC-3',下游引物為5'-GATTGAATC GAGCACCAGTTAC-3'。PCR 條件：95℃ 15 min；95℃15 s，55℃30 s，72℃30 s，40 個循環。以U6基因為內參，上游引物為5'-CGCTTCGGCAGCACA TATACTA-3'，下游引物為5'-GATTGAATCGAGCA CCAGTTAC-3'，PCR 條件同上。各組PCR 均進行3復孔重復。

1.4 CCK8法及克隆形成實驗檢測細胞增殖

將轉染24 h 的細胞以每孔2×103/100 μL 的密度接種于96 孔板，培養24、72 和120 h 后分別進行CCK8 檢測。加入10 μL CCK8，繼續在37℃、5%CO2條件下培養4 h，檢測D450nm值，每組均進行6 復孔重復。增殖倍數計算公式：每一次測定的吸光度值/第一次測定的吸光度值。

轉染后將細胞以2×103/孔的密度接種于6孔板，37℃、5% CO2條件下培養，每3 d 換液，2 周后棄去培養液，PBS 洗3 次，加入0.1%結晶紫溶液（含10%福爾馬林）固定20 min，棄去結晶紫溶液后用自來水柔和沖洗，自然干燥后照相保存。

1.5 Transwell實驗檢測細胞的浸潤能力

-20℃保存的Matrigel于4℃過夜融化，用無血清培養基以1∶6 稀釋Matrigel，充分混勻；取400 μL 稀釋的Matrigel 加入Tanswell 板上室，37℃30 min 后Matrigel聚合成膠；細胞用PBS漂洗3次，用無血清培養基制備單細胞懸液，每個小室加入5×105細胞，置于6孔板中，48 h后觀察照相并計數。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 pcDNA3.0-miR-155真核表達載體的鑒定

用限制性內切酶HindⅢ/XhoⅠ對pcDNA3.0-miR-155 質粒進行雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳，在350 bp 及5.4 kb 左右出現條帶，符合預期結果（圖1）；測序后與GenBank（NR_030784）序列比對一致。

2.2 miR-155 在SK-HEP-1 及MHCC-97H 肝癌細胞系中的表達

將SK-HEP-1 及MHCC-97H 肝癌細胞培養至密度為70%～80%（圖2），細胞狀態良好，呈長梭形（SK-HEP-1）或多邊形（MHCC-97H）上皮樣細胞狀態。轉染pcDNA3.0-miR-155 質粒72 h 后，對SKHEP-1 及MHCC-97H 細胞進行實時定量PCR，以檢測miR-155的表達情況，以轉染pcDNA3.0質粒為對照，結果顯示陽性組比對照組表達水平高約424.8±48.5倍（SK-HEP-1，P＜0.01）與63.69±7.8倍（MHCC-97H，P＜0.01）（圖3），這說明pcDNA3.0-miR-155 質粒能有效地高表達成熟的miR-155。

2.3 miR-155高表達對細胞增殖的影響

CCK8 法檢測結果表明，pcDNA3.0-miR-155 質粒轉染SK-HEP-1 及MHCC-97H 細胞24、72、120 h后，與轉染pcDNA3.0 對照載體組相比，在72 h 后細胞增殖受到明顯的促進，miR-155 質粒轉染組SKHEP-1 與對照組在72 h 的增殖倍數分別為4.59±0.14 與3.04±0.15（P＜0.01），miR-155 質粒轉染組MHCC-97H 與對照組在72 h 的增值倍數分別為3.78±0.12 與3.35±0.38（P＜0.01）（圖4）。克隆形成實驗是將單細胞懸液以較低的細胞密度接種于培養孔板中，經過相對較長時間的培養來考察單個細胞的增殖能力，miR-155 質粒轉染組SK-HEP-1 與對照組在72 h 的克隆形成數目分別為410.00±11.36 與189.33 ± 12.66（P＜0.01），miR-155 質粒轉染組MHCC-97H 與對照組在72 h 的克隆形成數目分別為226.00±6.08與144.33±14.98（P＜0.01）（圖5），說明miR-155促進了肝癌細胞的增殖。

圖1 pcDNA3.0-miR-155質粒的HindⅢ/XhoⅠ雙酶切鑒定

2.4 miR-155高表達促進細胞的浸潤能力

Transwell檢測結果表明，pcDNA3.0-miR-155質粒轉染組SK-HEP-1 與對照組浸潤數目分別為143.00±9.36與76.00.33±10.67（P＜0.01），二者差異具有顯著意義（P＜0.01）（圖6）。

3 討論

圖2 SK-hep1（A）及MHCC-97H（B）肝癌細胞（×200）

圖3 實時定量PCR檢測轉染pcDNA3.0-miR-155后SK-hep1及MHCC-97H肝癌細胞中miR-155的表達

圖4 miR-155促進SK-hep1及MHCC-97H肝癌細胞增殖

圖5 克隆形成實驗證明miR-155促進SK-HEP-1（A）及MHCC-97H（B）肝癌細胞增殖

圖6 侵襲實驗證明miR-155促進SK-HEP-1細胞的浸潤

越來越多的研究表明，除了腫瘤細胞本身發生的遺傳學或表觀遺傳學的改變之外，腫瘤細胞所處的微環境也在腫瘤的發生發展中扮演至關重要的角色[10-11]。腫瘤微環境包括內皮細胞、間充質干細胞、成纖維細胞、炎癥細胞及脂肪細胞等。我們課題組曾經系統研究肝腫瘤微環境對肝癌發生與發展的影響并取得一定的進展，發現了肝癌微環境中的肝星狀細胞及間充質干細胞等在腫瘤細胞的影響下呈現明顯激活狀態，高表達EPM 及S100-A4 等因子，進而對腫瘤細胞的生物學行為產生明顯影響：促進腫瘤的增殖，明顯增加了腫瘤細胞的浸潤能力，在腫瘤微環境激活細胞的刺激下，腫瘤細胞肝內轉移甚至肺轉移的能力增加[15]。進一步弄清腫瘤微環境中的這些因子的分子調控機制，將有望為明確腫瘤發生發展的病理機制，以及發現新的腫瘤診療靶標提供線索。

在前期工作中，我們發現在肝腫瘤微環境的刺激下，肝腫瘤細胞的生物學行為發生了改變，包括細胞的增殖、浸潤與轉移能力的提高等。此外，我們的研究也發現腫瘤細胞內的miRNA 表達譜發生了變化，包括miR-155、miR-301、miR-222、miR-107 等在內的miRNA 的表達明顯上調，其中miR-155 表達的改變最為顯著。miR-155 是一個典型的多功能基因，目前已被報道參與多種生理與病理過程，如炎癥反應、腫瘤的發生發展等。在急性髓細胞樣白血病中，miR-155 的表達明顯升高；此外，在多種實體瘤中，包括甲狀腺癌、乳腺癌、結腸癌及宮頸癌等，miR-155 的表達顯著上升，并可能與患者的病理分級及預后有一定的相關性，但其對腫瘤細胞的生物學作用及分子調控機制仍須進一步明確[16-17]。

為了進一步揭示肝腫瘤微環境是否通過miR-155 發揮其對腫瘤細胞生物學行為的影響，我們通過pcDNA3.0-miR-155載體在SK-HEP-1及MHCC-97H 肝癌細胞中高表達miR-155，并研究miR-155對腫瘤細胞增殖及浸潤能力的影響。研究結果證實，miR-155 發揮了與腫瘤微環境中的間質細胞類似的生物學作用，可以促進腫瘤細胞的增殖與浸潤能力，提示miR-155參與了腫瘤微環境，有促進腫瘤的發生與發展的過程。這有助于我們進一步明確肝腫瘤微環境作用的病理機制，而miR-155 在肝癌細胞中的高表達并對腫瘤細胞生物學行為造成影響，為臨床上肝癌的分子診斷及治療提供了新思路與新靶點。

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