球形芽孢桿菌C3—41菌株銨鹽利用特性及銨轉運蛋白質分析

梁運改 江瑩 金琪 蔡亞君

摘要：對球形芽孢桿菌（Lysiniacillus sphaericus）C3-41在不同銨鹽濃度中的生長進行了研究。結果表明，在銨鹽濃度為0.5～4.0 g/L范圍內時，菌株正常生長并形成毒素，但是芽孢形成時間隨銨鹽濃度的升高而提前。從該菌株中提取基因組DNA，通過PCR的方法克隆了其基因組中疑似銨轉運蛋白質的編碼基因amt基因序列（GeneID： 501248970）。為了研究amt基因在T7啟動子啟動下的表達，構建了表達質粒pETAMT并轉化進大腸桿菌中，對得到的重組菌株進行活性分析。結果表明，重組菌株E-pETAMT與對照菌株E-pET28a相比具有明顯的將銨鹽轉運進細胞內及將銨鹽分泌到細胞外的活性，即表明該amt基因編碼的蛋白質在重組菌株E-pETAMT中表達并表現出銨轉運蛋白質的活性。通過KEGG軟件對C3-41菌株氮代謝途徑的分析表明，銨鹽既用于其氨基酸的合成，也是部分氨基酸的代謝產物。

關鍵詞：球形芽孢桿菌（Lysiniacillus sphaericus）；銨鹽；銨轉運蛋白質；活性；氮代謝

中圖分類號：Q786 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）21-5240-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.010

Ammonium Utilitation and Ammonium Transporter Analysis of

Lysinibacillus sphaericus C3-41 Strain

LIANG Yun-gai， JIANG Ying， JIN Qi， CAI Ya-jun

（Environmental Engineering College， Wuhan Textile University， Wuhan 430073， China）

Abstract： The effect of ammonium on Lysiniacillus sphaericus C3-41 strain was studied， and the result showed that， at the concentration of 0.5～4.0 g/L，C3-41 strain grew in similar level and expressed binary toxins normally， but spores formed earlier at high concentration.The putative ammonium transporter encoding gene （amt， GeneID： 501248970） was cloned by PCR from Lysinibacillus sphaericus C3-41 genomic DNA. To express amt gene under T7 promoter （a vegetative promoter），the recombinant plasmid pETAMT was constructed and transformed into Escherichia coli BL21 strain. The generated recombinant strain E-pETAMT could transport ammonium into the cell and secrete ammonium to the extracellular. This result indicated that the protein encoding by amt gene had the activity of ammonium transporter. KEGG analysis of nitrogen metabolism for strain C3-41showed that ammonium could be used for amino acid synthesis，but also was the metabolite product of some amino acids.

Key words： Lysinibacillus sphaericus； ammonium； ammonium transporter； activity； nitrogen metabolism

氮素是所有生物體必需的營養物質，而銨離子是最容易被生物體吸收利用的氮源形式。銨離子在氮素代謝中有著重要地位，它既是生物體內所有氮源的最終代謝產物，同時也是生物體內合成的核酸、氨基酸和輔因子等含氮類化合物的底物，因此，在維持生物體內的氮素動態平衡中，相對穩定的銨離子庫具有重要意義。銨轉運蛋白質是一類存在于真核生物或原核生物細胞膜上的、能主動轉運NH4+的載體，它可將細胞所處環境中的微量NH4+轉運到細胞內成為其自身氮源，確保細胞內的NH4+濃度穩定和細胞代謝的正常進行。近年來，有關銨轉運蛋白基因克隆及功能鑒定的研究已有較多報道，銨轉運蛋白基因主要包括amtB、mep和rh三大類。其中mep基因主要分布在酵母中，rh基因主要分布在獼猴中，研究比較詳盡的是amtB基因，分布在細菌、古生菌和真核生物中，在不同類群中高度保守。其中在細菌中主要分布于氨氧化細菌、雀稗固氮菌、巨胞氮單胞菌、敏捷氮單孢菌、谷氨酸棒狀桿菌和枯草芽孢桿菌中[1]。

球形芽孢桿菌（Lysiniacillus sphaericus）C3-41菌株是中國科學院武漢病毒研究所蟲媒病毒媒介控制學科組分離的一株對蚊幼蟲高毒力的菌株，是中國第一個登記注冊的微生物殺蚊劑商品制劑。但是該菌在生產時不能利用糖類物質，其生長和提供能量的碳源只能由富含氨基酸的含氮物質提供。國外多采用胨化牛奶、合成和半合成的培養基進行發酵生產，發酵成本高；而國內普遍采用的是由農副產品（黃豆粉、花生餅粉、棉子餅粉、玉米浸出液和魚粉等）組成的培養基進行發酵，成本雖低，但由于其代謝過程中產生大量氨類物質，導致發酵液pH過高，影響菌株的生長和毒素的形成，發酵液的菌數和毒力均不高，也影響了該菌株作為安全高效的生物殺蟲劑的大規模推廣應用[2]。為研究該菌株對銨鹽利用的特性，解決其發酵時易受氨類物質影響的問題，本試驗首先研究了不同濃度銨鹽對球形芽孢桿菌C3-41菌株的菌體生長、芽胞形成及毒素表達的影響；其次對2008年完成的球形芽孢桿菌C3-41菌株全基因組[3]測序中的銨轉運蛋白的編碼基因（初步命名為amt）進行了研究，將amt基因在T7啟動子調控下進行了原核表達，并對表達產物是否具有銨鹽轉運及分泌的活性進行了分析；此外，通過KEGG軟件對C3-41菌株的氮代謝途徑進行了分析。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

球形芽孢桿菌C3-41菌株為中國科學院武漢病毒研究所蟲媒病毒媒介控制學科組分離保藏，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、BL21為筆者所在實驗室保存菌株。LB培養基（每升含10 g 蛋白胨，5 g酵母粉，10 g NaCl）：氨芐青霉素和卡那霉素使用濃度分別為50 μg/mL 和30 μg/mL。G-Tris培養基：每100 mL含1 mL 0.8% CaCl2·H2O，1 mL 20% （NH4）2SO4（添加量可按試驗需要變動），1 mL 20% 葡萄糖，5 mL 1 mol/L Tris-HCl pH 7.5，1 mL 5% K2HPO4，1 mL G-Tris鹽母液（含0.025% FeSO4·H2O，0.05% CuSO4，0.05% ZnSO4·7H2O，0.5% MnSO4·H2O，2.0% MgSO4），0.15 g酵母粉，pH 7.4。

1.2 主要試劑與儀器

所用內切酶以及用于質粒提取、PCR產物回收和DNA片段快速純化試劑盒均購自TaKaRa公司；其余常規試劑均為Sigma進口分裝。主要儀器有美國Biotec synergy HT全波長自動酶標儀，美國ABI 9800 PCR 儀，電泳系統為美國BioRad DNA 電泳系統和蛋白質電泳系統。

1.3 不同銨鹽濃度對球形芽孢桿菌C3-41菌株生長及毒素表達的影響分析

將菌株接入5 mL LB液體培養基，30 ℃、150 r/min培養過夜后按1∶100比例轉接入含不同濃度（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L）（NH4）2SO4的G-Tris 培養基中，30 ℃、150 r/min培養，在培養的0、8、24、48、72、96 h取樣。將樣品置于4 ℃冰箱中保存，至取樣完畢后對菌體生長狀況、芽孢數及菌體二元毒素表達進行測定分析。

菌體生長狀況分析方法：以吸光度表示菌體的生長狀況，利用分光光度計測定樣品在600 nm波長下的吸光度（OD600 nm），它是追蹤液體培養物中微生物生長的標準方法。

芽孢計數方法：取100 μL樣品離心，菌體用無菌水洗滌3次后加1 mL無菌水充分振蕩搖勻，80 ℃水浴處理20 min，然后將濃度進行系列梯度（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）稀釋，每個稀釋濃度涂布3個LB固體平板，30 ℃培養過夜后對平板上長出的菌落進行計數。

二元毒素的表達分析方法：球形芽孢桿菌對蚊幼的毒力主要依賴于在芽孢期產生的二元毒素。二元毒素是由等量的41.9 ku BinA和51.4 ku BinB蛋白質多肽組成，二者的同時存在是形成伴孢晶體所必需的，缺一不可。對菌株二元毒素表達的分析通過SDS-PAGE電泳進行。SDS-PAGE分析方法參照文獻[4]。

1.4 DNA的提取

大腸桿菌質粒DNA提取參照文獻[4]小量堿法進行。芽孢桿菌菌株的總DNA提取參照蔡亞君等[5]的方法進行提取。

1.5 幾丁質酶基因的PCR擴增

根據Genbank中球形芽孢桿菌C3-41菌株的銨轉運蛋白質基因amt的ORF（GeneID：501248970）全序列設計了擴增引物，引物序列為：AMT1：5′-GGATCCGGGATGGAGGAAATAATATTATC-3′（下劃線為BamHⅠ酶切位點），AMT2：5′-GTCGACGGGTTATATGTGTTGTTCTTCTTG-3′（下劃線為SalⅠ酶切位點）。擴增體系為：芽孢桿菌總DNA 0.1 μg，10×PCR reaction buffer 2.5 μL，2.5 pmol dNTPs，Taq DNA polymerase 1 U，引物各10 pmol，加ddH2O至25 μL。擴增程序為：94 ℃變性30 s，60 ℃退火90 s，72 ℃延伸3 min，循環30次；72 ℃延伸7 min。

1.6 用于amt基因原核表達的重組質粒的構建

以球形芽孢桿菌C3-41菌株總DNA為模板，AMT1/AMT2為引物，PCR擴增得到amt基因ORF，其兩端分別帶有BamHⅠ和SalⅠ酶切位點，PCR產物經PCR產物回收試劑盒純化回收后進行BamHⅠ/SalⅠ雙酶切。雙酶切后的PCR片段與表達質粒pET28a BamH Ⅰ/Sal Ⅰ酶切后的片段連接，將連接產物轉化E. coli BL21后在卡那霉素抗性LB平板上篩選克隆子，隨機挑取菌落提取質粒進行酶切鑒定，鑒定正確的質粒即為amt基因在質粒pET28a T7啟動子控制下表達的重組質粒，命名為pETAMT。

1.7 Amt蛋白質的表達及活性分析

將質粒pETAMT轉化E. coli BL21，質粒經酶切驗證后得到在T7啟動子下表達Amt蛋白質的重組菌株E-pETAMT，同時將表達質粒pET28a轉化菌株E. coli BL21后形成用于對照的重組菌株E-pET28a。

銨鹽吸收試驗：將重組菌株置于LB液體培養基中于37 ℃、200 r/min條件下進行活化培養，取1 mL培養液離心收集菌體；菌體用無菌水洗滌后轉接入100 mL銨鹽濃度分別為0.1、1.0、10.0 mmol/L的G-Tris培養基中，于37 ℃、200 r/min條件下進行培養，并于6、12、24 h時取樣檢測銨鹽濃度。

銨鹽分泌試驗：將重組菌株置于LB液體培養基中于37 ℃、200 r/min條件下進行活化培養，取1 mL培養液離心收集菌體；菌體用無菌水洗滌后轉接入100 mL不添加硫酸銨的G-Tris培養基中，于37 ℃、200 r/min條件下進行培養，并于6、12、24 h時取樣檢測銨鹽濃度。

銨鹽濃度測定通過納氏試劑比色法[6]進行。

2 結果與分析

2.1 銨鹽濃度對球形芽孢桿菌C3-41菌株生長及毒素表達的影響

2.1.1 銨鹽濃度對C3-41菌株菌體生長的影響 在銨鹽濃度為0.5～4.0 g/L范圍內，不同銨鹽濃度對培養基的初始pH影響不大，pH為7.5～8.0，在芽孢萌發的適合pH內[7]；加入C3-41菌液培養后，培養液的pH維持在7.0～8.5，也始終處于適合C3-41菌體生長的范圍內（pH 3～9）[2]。對樣品的生長狀況檢測結果（圖1）表明，在銨鹽濃度為0.5～4.0 g/L范圍內，其所導致的培養基不同初始pH對C3-41菌體生長影響不大。在培養的0～8 h，菌體生長都處于延滯期；培養到8～24 h ，菌體生長開始進入對數生長期；到培養24 h以后，菌體生長均進入緩慢生長時期；在培養至96 h時，樣品的OD600 nm取得最大值，分別為1.095、1.162、1.094、0.965、1.393。

2.1.2 銨鹽濃度對C3-41菌株芽孢形成的影響 通過對C3-41菌株在含不同濃度銨鹽的培養基中培養的不同時段的菌液中的芽孢進行計數，得到結果如表1所示。由表1可知，在含不同濃度銨鹽的培養基中培養時，芽孢數均隨著時間的延長而增加；且在相同時間段的樣品中，芽孢數總體上隨著銨鹽濃度的增加而增加，銨鹽濃度越高，芽孢形成的時間越早。

2.1.3 銨鹽濃度對C3-41菌株二元毒素形成的影響 取100 μL C3-41菌株在不同銨鹽濃度培養基中培養至96 h的菌液進行離心，并用無菌水洗滌菌體后進行SDS-PAGE電泳分析，結果（圖2）表明，在0.5～4.0 g/L銨鹽濃度范圍內，不同濃度及其所導致的培養基不同初始pH對C3-41菌體二元毒素的形成沒有顯著影響，各樣品的二元毒素都能正常表達，41.9 ku和51.4 ku蛋白質條帶均可見。

2.2 Amt蛋白質的生物信息學分析

2.2.1 Amt蛋白質一級結構的預測 根據amt基因的氨基酸序列，通過蛋白質序列分析工具ProtParam（http：//www.expasy.ch/toots/protparam.html）分析Amt蛋白質的分子質量、理論等電點（pI）、氨基酸組成及半胱氨酸（Cys）數目、帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）和帶負電荷的氨基酸（Asp+Glu）數目。結果顯示，蛋白質由433個氨基酸殘基組成，分子質量為45 627.1 u，pI為5.40，含2個Cys，Arg+Lys為18個，Asp+Glu為28個。

2.2.2 Amt蛋白質二級結構的預測 采用ProtParam工具進行Amt蛋白質二級結構在線預測，結果顯示，Amt蛋白質的二級結構中含有大量的α螺旋和無規則卷曲，α螺旋占48.27%，無規則卷曲占43.19%，延伸鏈占8.55%，無β轉角。

2.2.3 Amt蛋白質跨膜區域預測 采用ProtParam工具進行Amt蛋白質跨膜結構在線預測，結果（圖3）顯示，Amt蛋白質有11個胞內向胞外的跨膜結構域和10個胞外向胞內的跨膜結構域。

2.2.4 Amt蛋白質序列分析 將amt基因翻譯得到的Amt蛋白質序列與Genbank中其他銨轉運蛋白質序列進行比對，結果顯示球形芽孢桿菌的Amt蛋白質序列與芽孢桿菌屬菌株Lysinibacillus fusiformis、Bacillus sp. B14905、L. boronitolerans、L. sphaericus、B. isronensis、B. licheniformis的Amt蛋白序列相似性分別為97%、96%、94%、89%、71%和61%，與2個Escherichia coli菌株的Amt蛋白質序列相似性均為 28%，結果見圖4。說明該蛋白質種內差異性小，種間差異性大。

2.3 用于Amt蛋白質表達的重組菌株的構建

正確的克隆質粒經BamHⅠ/SalⅠ雙酶切后，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收amt基因片段（1 302 bp），與表達質粒pET28a BamHⅠ/SalⅠ酶切后的片段（5 369 bp）連接，連接產物轉化E. coli DH5α后在卡那霉素抗性LB平板上篩選克隆子，隨機挑取菌落提取質粒進行BamHⅠ/SalⅠ酶切鑒定，鑒定正確的質粒即為amt基因在質粒pET28a T7啟動子控制下表達的重組質粒，命名為pEAmt，結果見圖5。將質粒pEAmt轉化入E. coli BL21，得到用于誘導表達的重組菌株E-pEAmt。

2.4 重組菌株的銨鹽吸收測定

將重組菌株E-pEAmt和E-pET28a在分別含有0.1、1.0、10.0 mmol/L銨鹽的G-tris培養基中，37 ℃、200 r/min條件下培養，于6、12、24 h取樣檢測OD600 nm及銨鹽濃度，結果見表2。由表2可知，在含有銨鹽的培養基中，在同樣條件下培養時，菌株E-pEAmt的生長量明顯高于菌株E-pET28a，表明菌株E-pEAmt比菌株E-pET28a能更好地利用銨鹽用于菌體生長，且在0.1～10.0 mmol/L銨鹽濃度范圍內，銨鹽濃度變化對菌體生長影響不大。在培養過程中，菌株E-pET28a培養液從培養6 h起即產生銨鹽積累，比原始培養基中銨鹽濃度顯著提高，而菌株E-pEAmt培養液則在培養24 h時才出現少量銨鹽積累。綜合以上結果，表明菌株E-pEAmt通過amt基因的表達，具備了將銨鹽轉運進細胞內的功能。

2.5 重組菌株的銨鹽分泌測定

將重組菌株E-pEAmt和E-pET28a在不添加硫酸銨的G-tris培養基中于37 ℃、200 r/min條件下進行培養，于6、12、24 h取樣檢測OD600 nm及銨鹽濃度，結果（表3）顯示，2個重組菌株生長量無顯著差別，二者在培養初期都從培養基中吸收銨鹽，使培養基中銨鹽濃度降低，但隨著培養時間的延長、菌體數量的增多，菌株E-pEAmt培養液中銨鹽濃度增加，結合表2的結果，表明菌株E-pEAmt在培養初期利用培養基中的銨鹽作為營養物質，而此后由于菌株的代謝又會產生大量銨鹽，將銨鹽分泌到細胞外。

3 討論

在本研究中，首先對球形芽孢桿菌C3-41菌株在不同銨鹽濃度的G-tris培養基中的生長及毒素表達進行了檢測，結果顯示，在含量高達4.0 g/L（約3 mol/L）的銨鹽培養基中其菌體生長量基本不受影響，也能正常表達二元毒素，但是其芽孢的形成時間隨銨鹽濃度升高而提前。通過對球形芽孢桿菌C3-41菌株的全基因組測序結果分析，其中含有一個編碼假定銨轉運蛋白質的amt基因，本研究將amt基因在T7啟動子下于大腸桿菌中表達，其重組菌株既能吸收銨鹽，也能將銨鹽由體內分泌到體外，表明該amt基因在C3-41菌株中編碼的確實是銨轉運蛋白質。通過KEGG軟件對C3-41菌株的氮代謝途徑進行分析，如圖6所示，該菌株不能利用糖類物質（N-乙酰氨基葡萄糖除外）作為碳源，也不能利用無機氮作為氮源，只能利用氨基酸、蛋白質，其分析結果與之前對C3-41菌株營養需求的研究結果[8]基本一致。在該分析結果中，銨鹽既用于合成氨基酸，也是多個氨基酸的降解產物，這也表明其菌體中銨轉運蛋白質存在的必要性；另外發現，C3-41菌株能將銨鹽合成纈氨酸和異亮氨酸，但這兩種氨基酸卻不能降解生成氨類物質。對球形芽胞桿菌C3-41菌株銨轉運蛋白質及銨鹽代謝的分析有助于指導其發酵工業生產。

參考文獻：

[1] 陶文娜.刺糖多孢菌amt基因的克隆與功能研究[D].長沙：湖南師范大學，2012.

[2] 劉娥英，張用梅，蔡昌建，等.球形芽胞桿菌C3-41菌株的生物學特性[J].中華流行病學雜志，1989（10）：1-6.

[3] HU X， FAN W， HAN B， et al.Complete genome sequences of the mosquitocidal bacterium Bacillus sphaericus C3-41 and comparison with closely related Bacillus species[J]. J Bacteriol， 2008， 190（8）：2892-2902.

[4] SAMBROOK J， FRITSCH E F， MANIATIS T. Molecular Cloning： A Laboratory Manual[M].2nd. New York，USA： Coldspring Harbour Laboratory Press， 1989.

[5] 蔡亞君，袁志明，胡曉敏，等.蘇云金芽孢桿菌幾丁質酶基因的克隆及誘導表達[J].湖北農業科學，2011，50（3）：599-602.

[6] 中國標準出版社第二編輯室.中國環境保護標準匯編水質分析方法[M].北京：中國標準出版社，1996.

[7] 喻子牛.蘇云金芽胞桿菌制劑的生產與應用[M].北京：農業出版社，1993.

[8] 劉冬棟，劉娥英，張用梅，等.滅蚊球形芽孢桿菌B.S C3-41營養需求的研究[J]. 衡陽醫學院學報，1999，27（1）：14-16.