Box—Behnken設計優化蒙古口蘑多糖的超聲提取工藝

王治寶 王剛 王阿嬌 康倩倩 王金

摘要：利用響應面分析法對蒙古口蘑（Tricholoma mongolicum）多糖的超聲輔助提取工藝進行優化。在單因素試驗的基礎上，選取提取時間、提取溫度和超聲功率進行3因素3水平的Box-Behnken中心組合研究，應用Design-Expert軟件對試驗結果進行分析。結果表明，建立的二次方程模型擬合度良好（R2為0.988 4），各因素對多糖得率的影響順序依次為超聲功率、超聲時間、提取溫度。最佳提取條件為提取溫度45 ℃，超聲時間21 min，超聲功率290 W。在此條件下，蒙古口蘑多糖得率為19.53%，與預測值（19.76%）高度符合。

關鍵詞：蒙古口蘑（Tricholoma mongolicum）；多糖；超聲提取；Box-Behnken 設計

中圖分類號：S646.1+9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）21-5391-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.048

Optimization of Ultrasound-assisted Extraction of Polysaccharides from

Tricholoma mongolicum Using Box-Behnken Design

WANG Zhi-Bao1，WANG Gang2，WANG A-jiao3，KANG Qian-qian1，WANG Jin1

（1.Department of Pharmacy， Hebei North University， Zhangjiakou 075000，Hebei， China； 2.Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co. Ltd， Shijiazhuang 050035， China； 3.Department of Pharmacy， the Peoples Hospital of Langfang City， Langfang 065000， Hebei， China）

Abstract： The ultrasound-assisted extraction of crude polysaccharides from Tricholoma mongolicum with water was investigated using response surface methodology. On the basis of single factor test，three variables， including extraction temperature， extraction time and ultrasonic power were studied and Box-Behnken design was employed to optimize the extraction parameters. A multiple regression analysis was used to fit the second-order polynomial equation to the experimental data with a high correlation coefficient （0.988 4）. According to the significance of regression coefficients of quadratic model and gradient of slope in plots， ultrasonic power was the most remarkable factor affecting the TMIPs yield， followed by extraction time and extraction temperature. The results showed that the optimal conditions as follows： extraction temperature 45 ℃，extraction time 21 min and ultrasonic powe 290 W. Under the optimum conditions， the yield of experiment was 19.53%， which is consistent with the predicted value by RSM model（19.76%）.

Key words： Tricholoma mongolicum；polysaccharides； ultrasound-assisted extraction； Box-Behnken design

蒙古口蘑（Tricholoma mongolicum），又稱白蘑、口蘑，主要分布于中國河北、內蒙古、黑龍江、吉林、遼寧等地[1，2]。蒙古口蘑不僅味美獨特，還可入藥，其性平、味甘，有宣腸益氣、散熱解表的功效。現代藥理研究表明，植物多糖具有抗疲勞、調節血脂、降血糖、免疫調節、防癌抗癌等作用[3-6]，因此從天然產物及菌類中開發具有生物活性的多糖成分倍受關注。本試驗采用超聲輔助技術提取蒙古口蘑多糖，并采用Box-Behnken設計對其提取工藝進行優化，為進一步開發蒙古口蘑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒙古口蘑購自于當地超市，粉碎，過40目篩備用。D-葡萄糖購于上海阿達瑪斯試劑有限公司，濃硫酸、苯酚、乙醇均為分析純，水為蒸餾水。

KQ-400KDE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.2 多糖的測定

精確稱取標準品葡萄糖200 mg，置于50 mL量瓶中，加水定容至刻度，即得到對照品溶液。

精確稱取5.0 g口蘑粉末，加水100 mL，超聲提取，提取液離心（3 000 r/min，5 min），取上清液10 mL定容至25 mL量瓶中，得到供試品溶液[7]。

1.3 線性關系考察

精確吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于25 mL具塞比色管中，分別加入蒸餾水補足至2.0 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，濃硫酸5.0 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置10 min，沸水浴5 min，冰水浴冷卻5 min，搖勻，同時以未加對照品的比色液為空白，于490 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，質量濃度為橫坐標進行線性回歸分析。

1.4 單因素試驗

1.4.1 提取溫度對多糖得率的影響 精確稱取蒙古口蘑10 g，每克材料加入蒸餾水20 mL，分別在30、40、50、60、70 ℃下進行超聲分析（超聲功率為200 W）提取蒙古口蘑多糖30 min，分析不同提取溫度對蒙古口蘑多糖得率的影響。

1.4.2 超聲時間對多糖得率的影響 精確稱取蒙古口蘑10 g，每克材料加入蒸餾水20 mL，在超聲功率為200 W，提取溫度50 ℃條件下，對蒙古口蘑分別提取10、15、20、25、30、35 min，分析不同超聲時間對蒙古口蘑多糖得率的影響。

1.4.3 超聲功率對多糖得率的影響 采用料液比（1∶20，g∶mL），分別以200、240、280、320、360 W的超聲功率于50 ℃超聲提取20 min，分析不同超聲功率對蒙古口蘑多糖得率的影響。

1.5 Box-Behnken設計及模型擬合

根據單因素試驗結果，影響多糖得率的因素主要有提取溫度（X1）、超聲時間（X2）和超聲功率（X3）。以這3個因素為主要影響因素，以蒙古口蘑多糖為評價指標進行試驗設計，試驗因素及水平見表1。采用Design-Expert程序對Box-Behnken中心組合試驗結果進行回歸分析。

1.6 驗證試驗

為了驗證模型與試驗結果是否相符，進行3組平行試驗對其進行驗證。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

以吸光度為縱坐標，質量濃度為橫坐標進行線性回歸分析，得到的回歸方程為y=0.002 3x+0.040 1 （r=0.999 6），表明葡萄糖在32.0～160.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 提取溫度對多糖得率的影響 由圖1a可知，隨著提取溫度的升高，蒙古口蘑多糖得率明顯升高；但當提取溫度高于50 ℃時，多糖得率有所下降。因此，超聲提取蒙古口蘑，適宜的提取溫度為50 ℃。

2.2.2 超聲時間對多糖得率的影響 由圖1b可知，在初始階段，隨著提取時間的延長，蒙古口蘑多糖得率迅速升高，在提取20 min時出現最大值，之后略有下降。主要原因可能是超聲效應破壞細胞壁，有利于多糖的釋放，但是過長的超聲時間可能會破壞多糖的結構。因此，適宜的超聲時間為20 min。

2.2.3 超聲功率對多糖得率的影響 由圖1c可知，蒙古口蘑多糖得率隨著超聲功率的增大呈上升趨勢，當超聲功率為280 W時達到最大值。因此，適宜的超聲功率為280 W。

2.3 Box-Behnken試驗結果

根據單因素試驗結果，影響蒙古口蘑多糖得率的因素主要有提取溫度（X1）、超聲時間（X2）和超聲功率（X3）。以這3個因素為主要影響因素，以蒙古口蘑多糖得率為評價指標進行試驗設計，試驗結果如表2所示。回歸模型方差分析結果如表3所示。

采用Design-Expert程序對所得數據進行分析，經擬合得到回歸方程如下：

Y=-272.593+0.933×X1+7.384×X2+1.329×X2-0.027×X1X2+0.000 69×X1X2+0.006 9×X2X2-0.006 2×X■■-0.019 2×X■■-0.002 6×X■■

由表3方差分析結果可知，該回歸模型P<0.001，方程模型顯著，失擬項P=0.082 7>0.05，不顯著，說明試驗方法準確可靠。回歸模型的總決定系數（R2）和調整決定系數（Adj R2）均大于0.95，說明方程擬合程度較好，試驗誤差小，該回歸方程可用于超聲提取蒙古口蘑多糖的分析和預測。在所選各因素的范圍內，影響多糖得率的順序為超聲功率、超聲時間、提取溫度。

2.4 響應面優化預測及驗證試驗

根據擬合得到的二次多項式方程，制作蒙古口蘑多糖得率的效應曲面（圖2）。由圖2可知，超聲功率（X3）和超聲時間（X2）對多糖得率的線性效應顯著，X■■和X■■對蒙古口蘑多糖得率的曲面效應極顯著，X1X2和X2X3交互作用顯著。對回歸方程求一階導數，當響應值（多糖得率）有最大值時，各因素分別為提取溫度44.78 ℃， 超聲時間21.25 min和超聲功率290.37 W，在此條件下蒙古口蘑多糖得率的預測值為19.76%。

2.5 驗證試驗

為了驗證模型與試驗結果是否相符，進行3組平行試驗對其進行驗證，考慮到實際操作的可行性，驗證試驗中采用提取溫度45 ℃，超聲時間21 min和超聲功率 290 W。結果表明，蒙古口蘑多糖平均得率為19.53%，與模型預測值非常接近，說明基于響應面法所得的優化工藝參數比較可靠，具有一定的實用價值。

3 小結

響應面優化法通過考察影響因素的響應面，從效應面上選擇合適的響應區，確定自變量的取值范圍[8，9]。此方法利用非線性數學模型擬合回歸方程，在中心點重復試驗以減少試驗誤差，提高準確度，具有試驗次數少、預測性好等優點，廣泛應用于中藥提取工藝優化[10，11]。本試驗通過單因素試驗分析，選用3因素3水平Box-Behnken試驗設計，建立各因素與蒙古口蘑多糖得率的回歸模型，繪制三維效應曲面圖和二維等高線圖，預測了最佳提取工藝條件，驗證試驗表明實測值與預測值較為接近，說明該模型可用。

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