蒸氣爆破預處理蘆葦酶解工藝優化及產物分析

朱作華 蔡霞 嚴理 李智敏 謝純良 胡鎮修 彭源德

摘要：蘆葦（Phragmites australis）是一種有潛力的能源作物，為優化蘆葦酶解糖化工藝，應用Plackett- Burman試驗設計篩選影響蘆葦酶糖化的重要參數，通過Box-Behnken設計確定重要參數的最佳水平，應用高效液相色譜儀（HPLC）對糖化過程中的單糖種類及含量進行分析。結果表明，影響蘆葦酶糖化的重要參數是H2SO4濃度、Tween-80和MnSO4濃度，最佳工藝參數為H2SO4濃度0.88%、表面活性劑Tween-80添加量0.61%、MnSO4添加量0.26%，在此條件下，8～10 h可以完成糖化，總還原糖濃度達到45.68 mg/mL，同時驗證了數學模型的有效性，液相分析表明糖化液中主要的糖種類為葡萄糖和木糖，其含量分別為21.36、16.62 mg/mL，阿拉伯糖、纖維二糖和半乳糖含量較少。

關鍵詞：蘆葦（Phragmites australis）；Plackett-Burman設計；Box-Behnken設計；酶解；響應面法

中圖分類號：S216.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）21-5387-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.047

Hydrolysate Alalyze and Enzymatic Saccharification Conditions Optimization of Reed by Steam Explosion Pretreatment

ZHU Zuo-hua， CAI Xia， YAN Li， LI Zhi-min， XIE Chun-liang， HU Zhen-xiu， PENG Yuan-de

（Institute of Bast Fiber Crops， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410205， Hunan， China）

Abstract：Reed （Phragmites australis）was a kind of alternative raw material for bio-ethanol production. The important parameters of influencing enzymatic sacharification for reed were screened by Plackett-Burman design. Furthermore， based on Box-Behnken design， the enzymatic saccharification conditions of reed by steam explosion pretreatment were optimized by response surface methodology， and a mathematial model of a second order quadratic equation was developed for reducing sugar conentration. The hydrolysate was alalysed by HPLC. The resutlts suggested that the three important parameters included dilute sulphuric acid， Tween-80 and manganese sulfate concentration. The optimized technologial parameters were as follows： dilute sulphuric acid concentration 0.88%，、Tween-80 concentration 0.61%， manganese sulfate contration 0.26%. The reducing sugar concentration was up to 45.68 mg/mL. The results verified the validity of the mathematical model. The concentrations of glucose and xylose were 21.36 mg/mL and 16.62 mg/mL， respectly. Contents of arabinose， cellobiose and galactose were very low.

Key words：reed（Phragmites australis）； Plackett-Burman design； Box-Behnken design； enzymatic saccharification； response surface methodology

蘆葦（Phragmites australis）是多年生草本植物，分布廣泛、適應性強、生長快、產量高，不需要施肥，全世界約有1 000萬hm2，而我國現有14個蘆葦主產區，面積達130萬hm2以上[1，2]。目前，蘆葦在農村主要用于牲畜的草料和草墊等，工業上主要用作造紙原料[3，4]。蘆葦的產量和質量主要取決于當地的生長條件，每公頃產量15～35 t干基，莖桿纖維素含量40%以上，半纖維素含量30%左右，可用于燃料乙醇的生產，是一種很有潛力的可再生能源作物[5-7]。

由于木質纖維素原料本身的理化特性及結構組成的復雜性，酶有效降解纖維素前必須經過預處理過程[8，9]。目前，比較有效的預處理方法包括利用酸、堿等化學預處理和蒸氣爆破預處理。酸預處理能夠溶解掉半纖維素，但易產生副產物；堿預處理可以更有效地去除木質素，但半纖維素可能變為難溶的聚合物；生物法也可以取得良好的預處理效果，但處理時間較長[10-12]。蒸氣爆破法由于具有處理時間短、化學試劑用量少、污染小、能耗低等優點，被認為是木質纖維素原料有效的預處理方法之一。

影響纖維質原料酶糖化的因素很多，且各因素間可能存在交互作用，單因素試驗和正交試驗得到的結果不夠嚴密。響應面分析法可以設計試驗結果與參數變量間的關系，分析一次項、平方項和2個因子間的一級交互作用項的數學模型，近年來已經廣泛應用到工藝條件的確定[13-15]。本研究在前期化學預處理、蒸氣爆破預處理研究的基礎上，應用Plackett-Burman試驗設計篩選影響蒸氣爆破蘆葦糖化的重要參數，然后通過Box-Behnken設計及響應面分析確定蘆葦糖化重要參數的最佳水平。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆葦取自益陽市沅江洞庭湖區，經自然風干后剪碎。纖維素酶由高寶公司和湖南尤特爾公司提供，酶活力分別為2 587 U/mL和3 734.64 U/mL，木聚糖酶由廣東華芬酶有限公司和湖南尤特爾公司提供，酶活力分別為1 9425 U/mL和9 644 U/mL。硫酸、氫氧化鈉、葡萄糖、酒石酸鉀鈉、PMP等試劑均為分析純，3，5-二硝基水楊酸為生化純，甲醇、乙腈為色譜級，甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖為SIGMA-ALDRICH公司試劑。

1.2 儀器與設備

UX6200H型電子天平（日本島津公司）；Mettler Toledo Delta 320型精密pH計（瑞士梅特勒-托利多公司）；756型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；RH-Q型恒溫搖床（金壇榮華儀器制造有限公司）；移液器（德國EPPENDORF公司）；YXQ-LS-50SⅡ型高壓滅菌鍋（上海博訊實業有限公司）；UltiMate3000型高效液相色譜儀（美國熱電公司）；QB-200型蒸氣爆破機（鶴壁市正道重機廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘆葦酶解 稱取100 g蘆葦樣品，加入500 mL稀硫酸溶液浸泡10 h左右，使蘆葦樣品充分浸濕，濾去濾液，濾渣進行汽爆處理，氣爆壓力2.0 MPa，維壓時間120 s，氣爆后原料按一定比例加入蒸餾水，調節pH為5.5，加入適量木聚糖酶和纖維素酶進行酶解，酶解條件為48 ℃、150 r/min，48 h后分別測定總還原糖，取平均值。

1.3.2 Plackett-Burman試驗 Plackett-Burman設計是一種有效的兩水平試驗設計方法，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的因素。纖維素預處理酶水解工藝中涉及的參數較多，Plackett-Burman適合于本試驗設計， 根據前期試驗結果和相關文獻報道[5，6，16]，本試驗選取7個影響因子作為獨立考察的因素，見表1。

1.3.3 響應面優化試驗設計 在Plackett-Burman試驗的基礎上，根據Box-Behnken設計原理，對篩選的3個最重要影響因素（H2SO4濃度、Tween-80和MnSO4） 進行進一步優化研究，以酶解液中的總糖濃度為響應值進行響應面分析試驗，通過軟件計算分析確定重要試驗因子的水平，從而獲得最佳的蘆葦預處理酶水解工藝參數，其他參數為浴比1∶2，酶配比為10%高寶纖維素酶+5%華芬木聚糖酶，0.1%CoCl2，不添加Tween-20。

1.3.4 分析方法 酶解液中還原糖濃度采用DNS法測定[17]；葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖濃度的測定采用高效液相色譜法，使用高效液相色譜儀，檢測器為紫外檢測器，色譜柱為C18；流動相為0.1 mol/L硫酸銨和乙腈，體積比為81∶19，流速為1.2 mL/min，柱溫為30 ℃。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman篩選試驗

Plackett-Burman試驗設計及結果見表3，利用Design Expert軟件對試驗結果進行方差分析和系數的顯著性檢驗，試驗設計和結果見表4。“Prob>F”小于0.05時，表明該因素是重要的。“Model Prob>F”為0.032 5時，表明該模型是重要的。7個因素的重要性順序依次為H2SO4濃度、MnSO4、Tween-80、浴比、CoCl2、酶配比、Tween-20。

2.2 響應面試驗

Box-Behnken試驗設計及結果見表5，其中中心值重復3組試驗，利用Design Expert軟件對表5中數據進行多元回歸擬合，獲得響應值總還原糖濃度（Y）的二次多項式回歸模型為：Y=44.25-4.76×A-0.15×B+1.96×C+0.6×A×B+0.18×A×C-0.44×B×C-7.5×A2-0.62×B2-0.85×C2，進一步對回歸方程進行方差分析和顯著性檢驗，見表6。回歸模型方程的回歸系數為R2=0.98，方差分析顯示“Model Prob>F”為0.000 3，說明該模型是重要的，表明試驗點數據的擬合方法是合理的，該模型可用于預測蘆葦原料預處理后酶解糖化過程中總還原糖濃度的變化。顯著性水平（P<0.05）條件下，因素A和C對總還原糖糖濃度的線性效應顯著，因素B不顯著；因素A2對總還原糖濃度的曲面效應顯著，B2和C2不顯著；AB、AC、BC的交互作用不顯著。

通過上面多元回歸方程作響應曲面及其等高線圖，結果見圖1。

2.3 最佳工藝條件確定與驗證

在前面響應面分析的基礎上，通過軟件模擬，當H2SO4濃度為0.88%，Tween-80添加量為0.61%，MnSO4添加量為0.26%時，總還原糖濃度達到最大值46.40 mg/mL。為了檢驗模型預測的準確性，依據該參數處理蘆葦桿，其他參數不變，3次重復，總還原糖濃度分別達到45.05、45.79、46.20 mg/mL，平均值為45.68 mg/mL。試驗值與模擬值基本一致，表明該優化模型有較高的可靠性。

2.4 蘆葦酶水解過程產物分析

由圖2可以看出，對蘆葦酶水解過程的產物進行分析，0～8 h總還原糖濃度快速升高，反應進行到8 h時酶解液中總還原糖濃度達到最大值45.68 mg/mL，其后基本保持不變。HPLC檢測糖化液組分，結果表明，糖化液中葡萄糖濃度最高為21.36 mg/mL，其次為木糖16.62 mg/mL，阿拉伯糖、纖維二糖和半乳糖含量較少。隨著糖化時間的增加，葡萄糖、木糖含量的變化趨勢與總還原糖濃度的變化趨勢相似，阿拉伯糖、纖維二糖、半乳糖含量在整個反應測定的時間段內變化不大。

3 小結

本研究在前期蒸氣爆破預處理試驗及單因素試驗的基礎上，基于Plackett-Burman試驗設計原理，對影響蘆葦糖化的因素重要性進行篩選，獲得影響蘆葦糖化的最重要的三個因素為H2SO4濃度、Tween-80添加量和MnSO4添加量；進一步應用Box-Behnken試驗設計，以總還原糖濃度為響應值進行響應面分析，建立工藝數學模型，在此基礎上進行了工藝優化模擬。結果表明，H2SO4濃度和MnSO4添加量是影響蘆葦糖化的重要因素。最佳工藝條件為H2SO4濃度0.88%，Tween-80添加量0.61%，MnSO4添加量0.26%，糖化時間僅需8～10 h，總還原糖濃度達到最大值45.68 mg/mL，試驗值與模擬值基本一致，表明該優化模型有較好的可靠性，具有一定的指導意義。液相色譜分析表明，糖化液中糖種類主要為葡萄糖和木糖，其含量分別為21.36、16.62 mg/mL，還含有少量的阿拉伯糖、纖維二糖和半乳糖。

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