乙型肝炎病毒核酸實時熒光定量 PCR檢測在臨床診斷中的價值

魏留柱 （內蒙古自治區巴彥淖爾市臨河市人民醫院免疫科，內蒙古 臨河051000）

乙型肝炎病毒核酸實時熒光定量 PCR檢測在臨床診斷中的價值

魏留柱 （內蒙古自治區巴彥淖爾市臨河市人民醫院免疫科，內蒙古 臨河051000）

目的：探討實時熒光定量 PCR（FQ-PCR）檢測乙型肝炎病毒 DNA在臨床診斷中的價值．方法：對我院收治的190例乙型肝炎病毒感染患者的血清提取 DNA，采用實時熒光定量PCR檢測血清中HBV-DNA，ELISA法測定 HBV血清標記物．結果：FQ-PCR檢測的靈敏度和重復性良好，111例HBeAg（＋）／HBeAb（－）標本中FQ-PCR均呈陽性，HBV-DNA拷貝數1．04×107／mL，67例HBeAg（－）／HBeAb（＋）標本中，陽性率為58．2%，12例HBeAg（－）／HBeAb（－）標本中，陽性率為33．3%．結論：實時熒光定量 PCR可以實現準確定量檢測HBV-DNA，可使診斷更準確，治療更合理．

乙型肝炎病毒；熒光定量 PCR；免疫測定

0 引言

乙型肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的肝臟炎性病變，可引起多器官損害．該病是一類嚴重威脅人類健康的世界性傳染疾病，屬于散發性疾病，一年四季均可發病，近年來發病趨勢一直上升［1］．實時熒光定量 PCR實現了 PCR從定性到定量的飛躍，是檢測乙肝病毒血癥最敏感的方法，與常規 PCR相比，具有特異性更強、自動化程度高等特點，目前已廣泛應用于臨床疾病診斷［2］．本文對 190例乙型肝炎病毒核酸采用實時熒光定量 PCR法檢測，并與乙肝病毒標志不同模式進行對比，結果如下．

1 資料和方法

1．1 一般資料 選取我院 2013-06／2014-03傳染病科接診的 190例乙型肝炎病毒感染患者血清提取DNA，其中男123例，女67例，平均年齡34±5歲．

1．2 試劑與方法 采用 ELISA法檢測 HBV免疫標志物，匹基盒由上海信裕科技有限公司提供，嚴格按照匹基盒說明書操作，采用酶標儀進行結果判斷［3］．

采用實時熒光定量PCR法檢測HBV-DNA，嚴格按照匹基盒說明書進行操作，按照常規方法提取患者血清 HBV-DNA．具體操作為：取待測血清樣本和匹基盒中對照品各100 μL，10 000 r／min離心10 min；取上清液，加入100 μL DNA提取液 I，震蕩搖勻后，10 000 r／min離心10 min；棄上清，沉淀物中再加入25 μL DNA提取液 II，震蕩混勻，沸水浴 10 min，10 000 r／min離心10 min，取上清液備用［4］．取37．6 μL PCR反應液加入0．2 mL離心管中，再加 0．4 μL Taq酶及0．06 μL尿苷酶作為反應管，加入 2 mL處理樣本和對照品，設置對照品濃度梯度為 108，107，106，105，104，103copies／mL．

混勻后轉移至檢測區，采用核酸擴增儀進行PCR擴增，條件為：93℃預變性 2 s，94℃預變性 5 s，60℃預變性30 s，共40個循環，引物和探針由上海生工生物工程公司合成（表 1）［5］．

1．3 統計學處理 采用 STATA7．0統計分析軟件直線相關和回歸分析，對樣本數據進行χ2檢驗，P＜0．05為差異具有顯著性．

2 結果

2．1 PCR的靈敏度和重復性 將對照品 10倍稀釋，用實時熒光定量PCR測定，結果見圖1，以對數濃度為橫坐標，循環次數為縱坐標，具有良好的線性關系．將系列稀釋的對照品用熒光定量 PCR測定10次，每管重復3次，重復性結果見表2，表明PCR重復性良好．

表1 PCR所用引物和探針

圖1 HBV DNA的FQ-PCR標準曲線

表2 FQ-PCR的批內和批間重復性

2．2 FQ-PCR檢測血清 HBV-DNA結果 血清HBV-DNA與 HBV標記物 FQ-PCR檢測的結果見表3．

表3 HBV-DNA與HBV標記物FQ-PCR檢測結果

3 討論

臨床研究發現，急慢性肝炎的主要致病因子是乙型肝炎病毒（HBV），該病毒是一種 DNA病毒，對人和猩猩有易感性，引發乙型病毒性肝炎疾病．我國有2億人感染乙型肝炎病毒，且每年都呈增長趨勢，臨床資料顯示部分乙肝患者能夠形成持久免疫力，清除體內乙肝病毒，形成慢性感染患者，大多患者逐步演化為肝硬化，甚至肝癌．目前臨床診斷 HBV感染最敏感的方法是 PCR技術，能夠準確反映感染情況，縮短感染后的窗口期，PCR擴增技術能夠準確檢測一些血清學指標陰性的突變株DNA［6］．本文研究結果表明，實時熒光定量PCR技術檢測HBV-DNA具有較高的靈敏性和良好的重復性．ELISA方法檢測 HBV血清是診斷 HBV感染的標志性方法，具有高靈敏性和準確性，可以間接反映 HBV的表達和復制，臨床檢驗經驗發現，血清HBeAg陽性是HBV復制活躍、傳染性強的標志．本文研究結果表明，HBeAg陽性患者血清HBV-DNA陽性率及含量顯著高于其它患者（P＜0．005），HBeAg（＋）系統與HBeAg（－）系統比較，差異有顯著（P＜0．005）．綜上所述，ELISA法結合FQ-PCR技術能夠準確研究 HBV感染的自然進程，監測患者對抗病毒治療的反應，對 HBV感染的診斷、療效判定等有重要的指導意義．

［1］韓俊英，曾瑞萍．熒光定量 PCR技術及其應用［J］．國外醫學：遺傳學分冊，2000，23（3）：117－120．

［2］蔡葉琴，孫 彥，黃 黎．血清HBV－DNA與HBV免疫學標志物之間的相關性研究［J］．河北醫學，2011，17（2）：153－155．

［3］黃四爽，熊 勤．乙型肝炎病毒核酸實時熒光定量 PCR檢測在臨床診斷中的價值［J］．數理醫藥學雜志，2012，25（4）：484－485．

［4］陳素玲，胡國齡，譚德明．381例HBV感染者 HBV DNA前 C區基因突變的研究［J］．中國現代醫學雜志，2001，11（8）：48－50．

［5］Pas SD，Fries E，De Man RA，et al．Development of a quantitative real-time detection assay for hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays［J］．J Clin Microbiol，2000，38（8）：2897－2901．

［6］周 丹．乙型肝炎病毒DNA實時熒光定量PCR檢測在臨床診斷中的價值［J］．檢驗醫學與臨床，2010，7（20）：2271－2272．

The value of real-time fluorescence quantitative PCR in clinical diagnosis of HBV DNA

WEI Liu-Zhu
Department of Immunology，Linhe People's Hospital，Linhe 051000，China

AIM：To explore the value of the real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（FQ-PCR）in clinical detecting heptitis B virus（HBV）DNA．METHODS：The sera from 190 patients were measured by FQ-PCR，and the plasma markers were detected by ELISA．RESULTS：The detection sensitivity and reproducibility of FQ-PCR are excellent．There were 111 patients that the FQ-PCR results of HBeAg（＋）／HBe-Ab（－）samples were positive，with 1．04×107／mL of HBVDNA copy on the average．In the 67 patients'HBeAg（－）／HBe-Ab（＋）samples，the positive rate was 58．2%．In the 12 patients'HBeAg（－）／HBeAb（－）samples，the positive rate was 33．3%．CONCLUSION：FQ-PCR can ensure the accurate and quantitative HBV-DNA detection，accurate diagnosis and reasonable treatment．

HBV；fluorescence quantitative PCR；immunoassay

R512．6＋2

A

2095-6894（2015）01-134-02

2014-11-18；接受日期：2014-12-04

魏留柱．大專，主管檢驗師．研究方向：臨床檢驗．Tel：0478-8295982 E-mail：weifanchengw@163．com