老年2型糖尿病患者外周血內皮祖細胞的功能及數量

毛文文 尹列芬 田偉盟 陳國強 周 寧 申政磊 (昆明市第二人民醫院老年科，云南 昆明 65004)

內皮祖細胞(EPCs)亦稱內皮前體細胞，是指能分化增殖為成熟內皮細胞的一群祖細胞〔1〕。目前，EPCs介導的血管再生及損傷血管修復已經成為糖尿病(DM)、心血管疾病、腫瘤等疾病中的研究熱點，2型糖尿病(T2DM)中血管損傷機制的揭示受到許多學者的關注〔2，3〕。本研究觀察T2DM患者外周血EPCs數量及其功能，探討二者在T2DM發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1病例選擇 我院2009年9月至2012年10月老年科住院患者，共30例，男15例，女15例，年齡60～76歲，中位年齡65.2歲。經檢查確定無冠心病、高血壓、感染病史。正常老年對照組 10例，男7例，女3例，年齡60～75歲，中位年齡64.1歲，無糖尿病、冠心病、高血壓、近期感染等病史。

1.2材料與試劑 人淋巴細胞分離液、胎牛血清、M199培養液、二甲基亞砜(DMSO)、人纖維連接蛋白、流式細胞儀、DiI乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)、FITC標記荊豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-Ⅰ)(云南省腫瘤研究所);CD45-Cy5，CD133-RPE等標記(上海生物科技有限公司)。

1.3EPCs分離、鑒定、黏附數目檢測

1.3.1EPCs分離 取外周血10 ml，肝素抗凝，密度梯度離心法獲取單個核細胞。將單個核細胞接種在24孔板。M199培養基(含20%胎牛血清)培養4 d，用磷酸鹽緩沖(PBS)液洗掉非貼壁細胞，換培養液繼續培養至7 d，PBS液洗掉非貼壁細胞，貼壁細胞進行細胞鑒定。

1.3.2EPCs細胞鑒定 分離出外周血單個核細胞，按(2～3)×106/ml接種在纖連蛋白包被24孔板及6孔板(內置細胞爬片)，細胞爬片于培養第4天取出，收集細胞，流式細胞儀鑒定FITC標記荊豆凝血素Ⅰ(FITC-UEA-I)和DiI標記的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)雙陽性細胞為正常分化的EPCs。

1.3.3EPCs黏附數目(TNE-A)檢測 用0.25%胰蛋白酶消化收集貼壁細胞，懸浮在500 μl培養液并計數，然后將同等數目的EPCs鋪在24孔板，在37℃5%CO2孵箱培養1 h后，計數貼壁細胞。計數15個隨機200倍視野中貼壁細胞。

1.4EPCs的數量檢測(TNE)

1.4.1細胞表面標志 采用CD45-Cy5，CD133-RPE等標記。EPCs:CD133+/CD45-。

1.4.2檢測方法 采用熒光抗體標記，流式細胞儀檢測。抽取外周血3 ml，抗凝，血標本用PBS液2倍稀釋，Ficoll分離，1 800 r/min離心20 min，PBS洗2次。將細胞加入96孔板中，每孔5 ×105個細胞，加入抗體 5 μl，4 ℃ 孵育 30 ～60 min，用PBS液洗滌標本2次，100 μl的1%多聚甲醛固定，流式細胞儀檢測。

1.5統計學方法 采用SPSS13.3統計軟包，數據以s表示，組間比較采用方差分析，相關分析采用Spearman相關分析及Logistic多因素回歸分析。

2結果

2.1T2DM各組檢測指標與正常對照組情況 T2DM患者TNE-A(細胞數/200倍視野)較正常對照組顯著減少，并且血管病變各組間也有差異(t=2.185、2.099;P＜0.05)。T2DM患者外周血TNE較正常對照組減低(t=2.179;P＜0.05)，但血管病變各組間無差異(t=1.857;P＞0.05)。見表1。

表1 各組檢測指標水平比較(s)

表1 各組檢測指標水平比較(s)

與正常對照組比較:1)P＜0.05;與T2DM組及無血管病變組比較:2)P＜0.05

指標 T2DM組(n=30)無血管病變組(n=10)微血管病變組(n=10)大血管病變組(n=10)正常對照組(n=10)男/女(n)體重指數(kg/m2)空腹血糖(FBG，mmol/L)餐后血糖2 h(2 h PBG，mmol/L)糖化血紅蛋白(HbA1c，%)總膽固醇(TC，mmol/L)低密度脂蛋白(LDL，mmol/L)高密度脂蛋白(HDL，mmol/L)甘油三酯(TG，mmol/L)尿白蛋白/Cr(mg/g)收縮壓(SBP，mmHg)舒張壓(DBP，mmHg)血小板(×109/L)纖維蛋白原(g/L)TNE-A(個)EPCs計數(%)6/4 21.8±3.0 5.7±0.2 7.4±0.43－4.0±1.0 2.2±0.4 1.2±0.4 1.3±0.5－113.2±9.5 73.6±9.3 169 3.8 50.20±5.02 0.087±0.013 17/13 25.1±4.2 9.6±2.8 14.2±2.7 9.9±0.8 5.4±0.6 3.2±0.1 1.3±0.1 1.8±1.1 46.2±2.8 131.3±15.4 77.9±6.3 267 5.3 39.20±4.521)0.045±0.0031)6/4 24.6±1.5 11.1±3.5 13.9±4.2 9.6±2.7 5.1±1.3 2.8±0.9 1.1±0.1 1.5±0.7 43.9±2.5 141.9±13.4 78.6±6.5 256 4.2 41.15±3.271)0.040±0.0131)5/5 25.2±3.1 10.4±2.1 14.5±3.9 9.3±2.5 5.8±0.4 3.4±0.7 1.3±0.4 1.6±0.4 53.4±2.7 121.2±14.6 81.2±9.4 173 5.6 33.15±3.271)2)0.057±0.0131)4/6 24.9±3.2 11.6±3.6 14.6±4.1 10.7±4.1 5.7±0.9 4.9±0.5 0.9±0.3 2.0±1.7 69.9±5.1 132.4±25.3 80.9±12.2 362 4.7 28.23±2.871)2)0.049±0.0041)

2.2T2DM患者(按FBG分組)與正常對照組TNE-A對比 見表2。T2DM患者TNE-A較正常對照組顯著減少(t=2.872，P＜0.01);T2DM隨血糖升高，TNE-A逐漸降低，組間也有統計學差異(t=2.122，P＜0.05)。T2DM患者外周血TNE-A較正常對照組減低(t=2.855，P＜0.01);T2DM患者隨血糖升高，TNE-A也逐漸降低，組間有統計學差異(t=2.103，P＜0.05)。

表2 不同FBG水平的T2DM患者EPCs檢測結果(s)

表2 不同FBG水平的T2DM患者EPCs檢測結果(s)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;與其他組比較:2)P＜0.05，下表同

FBG(mmol/L)TNE-E(個)EPCs計數(%)＜7.8(n=7)39.20±4.521) 0.060±0.0101)7.8～11.1(n=11)33.15±3.271) 0.055±0.0111)＞11.1(n=12)28.23 ±2.871)2) 0.034±0.0211)2)正常對照組(n=10)50.20±5.02 0.087±0.013

2.3T2DM患者(按HbA1c分組)與正常對照組結果對比T2DM患者 TNE-A較正常對照組顯著減少(t=2.985，P＜0.01);T2DM患者隨HbA1c升高，TNE-A逐漸降低，組間有統計學差異(t=2.105，P＜0.05)。T2DM患者外周血TNE數較正常對照組減低(t=2.861，P＜0.01);T2DM患者隨HbA1c升高，TNE數逐漸降低，組間有統計學差異(t=2.175，P＜0.05)。見表3。

表3 不同HbA1c水平T2DM患者EPCs檢測結果(s)

表3 不同HbA1c水平T2DM患者EPCs檢測結果(s)

HbA1c水平 TNE-A(個)EPCs計數(%)＜8%(n=9)40.35±4.291) 0.071±0.0351)8% ～12%(n=10)32.21±4.011) 0.049±0.0251)＞12%(n=11)25.22±2.451)2) 0.030±0.0191)2)正常對照組(n=10)52.12±4.14 0.087±0.013

2.4T2DM患者相關性以及預后因素分析 Spearman相關分析顯示，TNE-A水平與LDL、DBP呈負相關(r分別為－0.40、－0.39，P ＜0.01)，與 2hPBG、HbA1c也呈負相關性(r分別為－0.21、－0.24，P＜0.05)。而外周血TNE數與FBG、HbA1c蛋白呈負相關(r分別為－0.231、－0.267，P＜0.05)。兩者與上述其他因素無關聯。以T2DM為整體，有血管病變為因變量(有 =1，無 =0)，以年齡、性別、SBP、DBP、BMI、HbA1c、TG、TC、LDL-C、HDL-C、FPG、2hPG、血小板計數、纖維蛋白原、TNEA、TNE數目等因素為自變量，進行Logistic回歸分析。最后SBP、TNE-A 進入回歸方程，常數為 －14.617、21.632。

3討論

目前研究發現，T2DM患者，特別在并發大血管病和微血管病時，體內循環內皮細胞(CECs)、EPCs均發生數量和功能的變化。糖尿病的嚴重程度與血管內皮損傷和功能障礙的程度密切相關〔1〕。大量研究顯示黏附分子、細胞因子、糖基化終末產物、脂類代謝紊亂等在分子水平上參與T2DM新生血管的形成，其中與上述因素有著密切關系的內皮細胞、EPCs的研究正成為熱點〔2，3〕。本研究參考國內外研究成果，從 EPCs入手，從其功能與數量兩方面探討其在T2DM患者體內的變化，并與相關臨床因素對比分析。

T2DM患者體內EPCs黏附細胞數可以反映其黏附功能，其參與血管生成、血管損傷修復等，在糖尿病血管病變發生中占有重要地位。而外周血EPCs的數量反映了內皮在各種因素刺激下的調控。本研究發現T2DM患者體內EPCs黏附細胞數較正常對照組顯著減少，并且隨血糖、血脂、血壓有一定的關聯。目前相關文獻〔4〕顯示糖尿病患者體內一些指標如可溶性細胞間黏附分子1、血漿假性血友病因子等參與糖尿病血管病變，但分析發現它們與血脂、血壓相關聯，而與血糖及HbA1c水平無明顯相關性，從而認為它們不是血糖升高的直接后果，而可能與DM患者體內蛋白質非酶糖化反應及氧化應激增強等因素有關。結合本研究結果提示EPCs的功能變化可能是體內代謝變化的聯系環節。同時，本研究外周血EPCs細胞數目與血脂、血壓等反映血管病變的因素相關性較低或無相關性的結果可能從另一個側面也支持上述結論。本研究提示EPCs細胞數目受到影響因素較多，早期代償機制是其數目增加的主要因素，隨著病變加重，代償機制失控，一方面數量會降低，另一方面即便數量增多，功能上存在缺陷，無法起到其應具有的功能，導致惡性循環，病情進展。因此針對 T2DM 的 EPCs移植治療〔5，6〕上，在保證EPCs數量的同時，其內在功能更應該受到重視。鑒于EPCs的研究剛剛起步，其生物學功能仍需進一步研究。

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