翼狀胬肉組織CyclinD1、MMP-3和colⅢ的表達及其臨床意義

趙小松 吳崢崢 鐘守國 (四川省人民醫院，四川 成都 610000)

翼狀胬肉主要以眼局部球結膜纖維血管組織增生導致角膜組織病變為臨床特征。目前，翼狀胬肉發生的病理機制尚未明確，臨床治療以手術為主，但術后復發率較高〔1〕。本研究通過免疫組化方法定位翼狀胬肉組織中的細胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質金屬蛋白酶(MMP)-3和Ⅲ型膠原(colⅢ)的表達程度在翼狀胬肉發病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集我院眼科2014年1月至2015年1月原發性翼狀胬肉患者46例作為病例組，均實施鼻側翼狀胬肉切除術，其中男22例，女 24例;年齡 55～78〔平均(59.26±6.32)〕歲;病程1～39年，平均(9.24±2.01)年;其中進行期30例，靜止期16例;視網膜脫離手術和斜視手術期間采集正常結膜組織39例作為對照組，其中視網膜脫離手術29例，斜視手術10例。

1.2檢測方法 ①試劑與儀器:兔抗人CyclinD1抗體(1∶200)購自美國Bioworld Technology公司，鼠抗人MMP-3單克隆抗體購自上海晶美生物科技公司，鼠抗人colⅢ酶單克隆抗體購自北京萊博生物科技公司，免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司，二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。②操作步驟:翼狀胬肉組織和正常結膜組織切除后即刻漂洗，清除表明血跡后即刻滴加40 g/L多聚甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，連續2 μm切片，常規蘇木素-伊紅(HE)染色與免疫組化染色，石蠟切片放置于65℃恒溫箱內烤片0.5 h，常規二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，放置于0.01 mol/L pH 6.0枸櫞酸鈉緩沖液中高壓高溫修復3 min，自然冷卻至常溫，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min×3次，3%H2O2溶液中常溫下孵育10 min，徹底消除內源性過氧化物酶活性，PBS洗5 min×3次，5%正常山羊血清中常溫下孵育0.5 h，滴加一抗，濕盒4℃低溫下過夜，PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗，37℃孵育0.5 h，PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色試劑盒顯色，直至出現棕黃色顆粒即可終止反應，采用自來水沖洗，HE復染，脫水透明，中性樹膠封片固定，常溫下自然干燥，顯微鏡下觀察，以CyclinD1、MMP-3和colⅢ陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3免疫組化結果判定〔2〕100倍高倍鏡下隨機選取5個視野，每個視野計數50個細胞，以細胞質或細胞核中出現淡黃色、棕黃色和棕褐色顆粒作為陽性細胞，并根據陽性細胞數目和染色強度兩方面綜合評估染色結果。①陽性細胞數目:根據陽性細胞百分率計分，其中陽性細胞百分率0%評定為0分，1% ～10%為1分，11% ～50%為2分，51% ～75%為3分，76% ～100%為4分;②染色強度:其中無染色評定為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;陽性細胞數目積分與染色強度積分相加即為總評分，≤3分為陰性表達，＞3分為陽性表達。

1.4統計學方法 應用SPSS18.0軟件進行分析，計量資料采用s表示行t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，并采用Pearson相關性分析。

2結果

2.1HE染色結果 翼狀胬肉頭部組織可見明顯的增生性血管形成改變，體部組織可見明顯變性樣改變，淺層基質見粗糙顆粒樣嗜酸性物質，深層基質見膠原組織彈力樣變粗糙、碎片、卷曲和斷裂狀纖維組織。正常結膜組織層次清晰，由排列工整的鱗狀上皮細胞組成，基質由疏松結締組織組成，膠原纖維平行排列，少量中性粒細胞和毛細血管形成。見圖1。

2.2兩組CyclinD1、MMP-3和colⅢ免疫組化染色比較 病例組CyclinD1、MMP-3和colⅢ免疫組化染色結果評分均明顯高于對照組(P＜0.05);三者陽性表達率也明顯高于對照組(P＜0.05)。見表1，表2，圖2。

圖1HE染色(×100)

表1 兩組免疫組化染色結果評分比較(s，分)

表1 兩組免疫組化染色結果評分比較(s，分)

組別 n CyclinD1 MMP-3 colⅢ46 6.45±1.21 6.12±0.95 5.98±0.75對照組 39 1.52±0.52 1.16±0.42 2.34±0.35 t/P值病例組23.64/＜0.001 30.18/＜0.001 27.83/＜0.001

表2 兩組CyclinD1、MMP-3和colⅢ陽性表達率的比較〔n(%)〕

圖2 免疫組化染色(×100)

2.3翼狀胬肉不同分期CyclinD1、MMP-3和colⅢ陽性表達率的比較 翼狀胬肉進行期CyclinD1、MMP-3和colⅢ陽性表達率明顯高于翼狀胬肉靜止期(P＜0.05)。見表3。

表3 翼狀胬肉不同分期CyclinD1、MMP-3和colⅢ陽性表達率的比較〔n(%)〕

2.4CyclinD1、MMP-3和colⅢ表達的關系 CyclinD1與MMP-3共陽性39例，共陰性4例，僅CyclinD1陽性2例，僅MMP-3陽性1例;Cyclin D1與colⅢ共陽性38例，共陰性3例，僅CyclinD1陽性3例，僅colⅢ陽性2例;CyclinD1與MMP-3、colⅢ表達呈明顯的正相關(r=0.623，0.712，P＜0.05)。MMP-3與colⅢ共陽性39例，共陰性5例，僅MMP-3或colⅢ陽性各1例，MMP-3與colⅢ呈明顯的正相關(r=0.706，P＜0.05)。

3討論

翼狀胬肉是局部球結膜及其纖維血管組織三角形膜樣增生導致角膜組織病變的眼表疾病，其主要病理特征為上皮層和基質層成纖維細胞增生，合并新生血管形成和炎癥組織浸潤。大量研究表明，翼狀胬肉可能通過影響正常細胞周期導致〔3〕。細胞周期主要分為分裂期和間期兩階段，而間期又分為DNA合成前期、DNA合成期和DNA合成后期，其中合成前期、合成期調控點是細胞周期最重要的調控點，在細胞周期進程中發揮決定性作用〔4〕。CyclinD1是重要的細胞周期調控蛋白，在DNA合成前期發揮正調節作用。生理狀況下，CyclinD1僅在DNA合成前期呈一過性表達，如CyclinD過度表達則促進細胞從DNA合成前期向DNA合成后期轉化，加快細胞周期進程，促進細胞的異常增生〔5〕。另一方面，翼狀胬肉通過轉化的角膜緣干細胞向角膜中央和結膜上皮侵犯，合并高血管化彈性和肥大增生和變性樣改變的細胞外基質(ECM)。ECM是由細胞合成并分泌的大分子物質，參與機體發育及細胞分化、增殖、遷移等細胞生理過程，同時在炎癥、腫瘤轉移、浸潤等病理過程中發揮重要的作用。MMP-3是鋅離子依賴性蛋白水解酶，具有廣泛性降解ECM，在ECM動態平衡的調節中發揮重要的作用〔6〕。同時，ECM不但對組織細胞發揮物理支持作用，而且通過細胞膜受體對細胞增殖分化、遷移、衰老、癌性病變和組織創傷修復等病理生理過程發揮控制和調節功能。膠原蛋白是構成ECM的主要結構蛋白質，一旦正常組織中的膠原纖維降解和生成平衡失調時，器官和組織將發生病變。翼狀胬肉組織增生和變性樣改變可能由于轉化型成纖維細胞含量增多和異常導致，從而colⅢ在翼狀胬肉組織中顯著性高表達〔7〕。colⅢ主要位于基質層的纖維板層間，呈點狀型分布，其翼狀胬肉組織表達增強在一定程度上提示了膠原纖維合成明顯增加，膠原纖維合成異常進一步促進翼狀胬肉疾病的發生和發展〔8〕。但關于翼狀胬肉組織CyclinD1、MMP-3和colⅢ的表達及其臨床意義研究甚少。

靜止期為翼狀胬肉長期類休眠狀態，不發展，胬肉厚度較薄，血管組織少，頭部無浸潤區，部分靜止期翼狀胬肉角膜無損害長達十余年;一旦接觸紫外線等促發因素時，翼狀胬肉發展至進行期，進展快速，胬肉充血肥厚，大量纖維血管組織增生，頭部見浸潤區，嚴重影響角膜和視神經功能〔9〕。翼狀胬肉進行期和靜止期交替出現，相互轉化，但其促轉化機制尚未明確。本研究結果揭示了通過增加CyclinD1、MMP-3和colⅢ陽性表達有助于促進翼狀胬肉靜止期向進行期轉化，加重翼狀胬肉病情嚴重程度，其與相關研究結果具有一致性〔10〕。而且 CyclinD1、MMP-3、colⅢ在翼狀胬肉組織中顯著增高，且在促進翼狀胬肉靜止期向進行期轉化過程中發揮重要的作用〔11〕。

綜上所述，通過顯著上調CyclinD1、MMP-3和colⅢ陽性表達以促進翼狀胬肉疾病的發生和發展，三者對翼狀胬肉的診斷具有重要的意義。

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