基于油酰乙醇胺的脂肪性肝炎新靶點機制及數據分析

施純禮 邱慧青 錢馨蔚 (福建醫科大學附屬第一醫院干部科，福建 福州 350004)

近年來，諸多研究表明非酒精性脂肪肝(NAFLD)和脂肪性肝炎(NASH)病理機制和白色脂肪組織的炎性反應關系密切〔1〕。過氧化物酶體增殖激活受體(PPAR)α可通過調控炎性基因的表達等抑制NASH。油酰乙醇胺(OEA)是一種具有調節脂代謝作用的內源性脂質。目前研究已證實〔2〕，OEA是PPARα受體的唯一高親和力內源性配子，其通過激活PPARα減輕體重，降低血膽固醇及甘油三酯(TG)含量，油紅染色表明OEA可糾正肝臟脂肪堆積。因此，基于OEA的內源性脂代謝調節作用，開發一種療效顯著且安全的調節脂類代謝和緩解肝臟脂肪性病變的藥物成為可能。本研究從細胞水平探析基于OEA的NASH新靶點機制。

1 資料與方法

1.1材料 人體肝腫瘤細胞株HepG2細胞(來源于上海基免實業有限公司)。OEA(上海居里生物試劑檢測中心)，高糖DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶均來源于美國Gibco公司，DMSO(美國Invitrogen公司)，醫用脂肪乳注射液(山東魯抗辰欣藥業)，非諾貝特、MTT、蘇木素、焦碳酸二乙酯(DEPC)、油紅O均來源于美國Sigma公司，總RNA抽提試劑Trizol(美國Invitrogen公司)，反轉錄試劑盒(日本 Toyobo公司)，PCR引物(上海基免實業有限公司)，TG測定試劑盒(北京北化康泰公司)。細胞培養板(美國corning公司)，ThermoForma細胞培養箱、超凈工作臺(均來源于蘇州凈化設備公司)，Olympus倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，快速恒溫水浴箱、低速臺式自動平衡離心機、低溫高速離心機、UV-2000紫外分析儀均來源于上海精宏實驗設備公司，DU800核酸蛋白分析儀(美國Beckman coulter公司)，熒光酶標儀、JY3000+型多用途電泳儀均來源于美國Molecular Devices公司，微量移液器(德國Eppondorff公司)，血細胞計數板、sartorius天平均來源于杭州納德科技有限公司，pH試紙(杭州特種紙業有限公司)。

1.2試劑配制 ①DMEM培養基:將已滅活的10%胎牛血清加于高糖DMEM培養基中，4℃保存。②配制細胞凍存液:(滅活胎牛血清:DMSO)=9∶1進行配制。③配制PBS緩沖液:將8.0 g NaCl、1.4 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4及0.2 g KCl溶解于1 L超純水中，調節pH值至7.2～7.4，滅菌，4℃保存。④配制胰蛋白酶:將0.25 g胰蛋白酶和0.01 g乙二胺四乙酸溶解于100 ml PBS溶液中，抽濾，滅菌，－20℃保存。⑤配制MTT:將25 mg MTT溶解于0.01 mol/L的5 ml PBS中，過濾，滅菌，備用。⑥配制油紅O染色液:將0.5 g油紅O溶解于100 ml異丙醇中，在60℃水浴鍋中振蕩30 min，過濾，4℃密光保存，待用時，預熱，染色時現配60%油紅O異丙醇染色液。⑦配制蘇木素染色液:取5 g蘇木素溶解于50 ml無水酒精中，待用;將100 g硫酸鋁鉀溶解于2 000 ml的三角燒瓶中，加熱溶解，待溫度達到90℃時，加入已制的蘇木素，待變為紫紅色時，加入2.5 g氧化汞，變為深紫色時，將三角瓶置于冰水中，避光，第2天過濾，加入40 ml冰醋酸，備用。⑧配制甲醛固定液:將10 ml 40%的甲醛溶解于90 ml雙蒸水中，加入1.1 g氯化鈣，調節pH至7.0。⑨配制溴乙錠(EB):取1 g EB溶解于100 ml DEPC·H2O中，置于棕色瓶中室溫下保存。⑩非變性瓊脂糖凝膠:將0.2 g Agarose加入至20 ml硼酸(TBE)中，微波加熱，冷卻至60℃ ～70℃加入2.5 μl EB，均勻混合倒入至膠板中，自然冷卻，備用。

1.3建立穩定的體外脂肪肝細胞模型 采用含有10%胎牛血清的DMEM培養HepG2細胞，以不同濃度油酸處理HepG2細胞24、48、72 h，以不加油酸的HepG2細胞為空白對照組;使用MTT試驗測定細胞活力，生存率，細胞分化活性;結合油紅染色，在光鏡下觀察細胞形態，確認脂肪肝細胞的形成;測定細胞內TG含量，篩選出脂肪乳誘導HepG2細胞形成脂肪肝細胞的最佳濃度和時間。

1.4OEA 作用 以 OEA(10、20、50、100 μmol/L)和非諾貝特(50 μmol/L)處理HepG2脂肪肝細胞，在不同的時間窗口(6、10、12 h)收集細胞，測定TG濃度;取RNA，使用定量PCR方法測定以下基因表達水平:PPARα、固醇調節元件結合蛋白(SREBP)-1c、去乙酰化酶(SirtI)、肉堿棕櫚酰轉移酶I(CPTI)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、乙酰輔酶A羧化酶(ACC);提取蛋白，使用Western印跡方法檢測PPARα、SREBP-1c、SirtI、CPT-I、LPL、TNFα、ACC 的表達水平。

1.5統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件進行t檢驗。

2結果

2.1油酸誘導HepG2細胞脂肪形成脂肪肝細胞的最佳濃度含≤0.25 mmol/L油酸的培養液培養 HepG2細胞24、48、72 h，細胞活力未見明顯下降，且不影響分裂、生長，油紅O染色及TG最高含量測定，當0.125 mmol/L濃度油酸造模培養24 h時，細胞內脂滴蓄積較少，因此，致NAFLD和NASH的最佳濃度為0.25 mmol/L油酸。

2.2各濃度油酸對細胞活力的影響 (1)對細胞活性和形態的影響:含≤0.25 mmol/L油酸的培養液對細胞活性無明顯影響;0.125 mmol/L油酸造模可見HepG2細胞邊緣清晰，但大部分為多角形，僅少量變圓;0.25和0.5 mmol/L油酸造模顯示細胞邊界不清晰，變圓，結合不緊密;≥1.0 mmol/L油酸造模細胞活性較少，見表1。(2)細胞模型TG含量:含0.25 mmol/L油酸組TG含量〔(5.516±0.262)mg/dl〕顯著高于空白對照組〔(1.260 ±0.104)mg/dl〕(P ＜0.05)。

表1 不同濃度油酸對細胞活性的影響(s)

表1 不同濃度油酸對細胞活性的影響(s)

與空白對照組比較:1)P＜0.05

組別 OD 活性變化(%)抑制率(%)0.125 mmol/L 1.006±0.037 98.9 1.0 0.25 mmol/L 0.942±0.024 92.6 8.0 0.5 mmol/L 0.885±0.0311) 86.7 16.0 1.0 mmol/L 0.846±0.0221) 83.2 18.0 1.5 mmol/L 0.728±0.0241) 71.4 29.0 2.0 mmol/L 0.601±0.0441) 59.3 41.0空白對照組1.017±0.025 － －

2.3不同濃度OEA處理模型12 h后細胞TG含量10 μmol/L 組，(4.237 ±0.128)mg/dl，20 μmol/L 組，(3.936 ±0.196)mg/dl，50 μmol/L 組，(3.348 ± 0.238)mg/dl，100 μmol/L 組，(3.493 ±0.222)mg/dl，50 μmol/L 非諾貝特組，TG 含量(3.458±0.245)mg/dl。各種濃度OEA模型的TG含量均顯著高于空白對照組(0.728±0.024)mg/dl(P＜0.05)。

2.4不同濃度OEA對基因表達的影響 50 μmol/L時，OEA可提高 PPARα、SirtI、CPT-I及 LPL 表達，降低 SREBP-1c、TNFα及ACC表達(P＜0.05)，見表2。

表2 不同濃度OEA對基因表達的影響(s)

表2 不同濃度OEA對基因表達的影響(s)

與空白對照組比較:1)P＜0.05

4.492±0.399 20 μmol/L 1.007±0.2311) 1.824±0.201 0.480±0.013 2.507±0.092 0.016±0.0011)0.000 2±0.000 21) 3.924±0.421 50 μmol/L 1.195±0.2391) 0.705±0.0751) 0.617±0.0581) 2.929±0.1121) 0.018±0.0011)0.000 3±0.000 11)1.765±0.5011)100 μmol/L 1.199±0.2381) 0.700±0.0741) 0.619±0.0571) 3.034±0.1151) 0.019±0.0011)0.000 3±0.000 11)1.741±0.5221)空白對照組 0.638±0.121 2.268±0.149 0.412±0.008 1.738±0.058 0.008±0.001 0.001 8±0.000 1 4.663±0.085非諾貝特組 0.926±0.2691) 1.771±0.194 0.390±0.001 2.940±0.1151) 0.009±0.001 0.000 4±0.000 11)3.022±0.2841)ACC 10 μmol/L 0.834±0.2271) 2.006±0.270 0.448±0.012 2.426±0.088 0.014±0.0011)0.000 2±0.000 11)組別 PPARα SREBP-1c SirtI CPT-I LPL TNFα

3討論

脂肪肝是慢性肝病及肝硬化等疾病最常見的病因。流行病學資料顯示，肥胖人群中脂肪肝患病率高達74%〔3〕。由于NAFLD和NASH的病理機制均與白色脂肪組織的炎性反應關系密切，同時靶點于肝臟細胞及脂肪細胞對探討NASH發病機制，預防肝硬化具有重要意義，可為從始動環節有效治療NAFLD和NASH奠定理論基礎。PPARα是一類核受體，由配子激活，主要分布在肝、腸黏膜、腎皮質及心臟等部位，可直接參與脂代謝等〔4〕。在肝臟中，PPARα可通過促進脂代謝、氧化反應，促進溶脂反應及抗炎癥作用，促進脂肪代謝〔5，6〕。PPARα可抑制TG含量，升高CPT-I、LPL含量及降低ACC的表達，促進脂肪代謝〔7〕。此外，PPARα還可直接調控炎癥基因的表達。OEA是一種內源性脂質，由18碳組成，具有調節脂代謝的作用。OEA可通過激活PPARα發揮減輕體重和降低血膽固醇及TG含量的作用，可糾正肝臟脂肪堆積。動物實驗表明〔8〕，OEA對高脂血癥的血脂調節主要是通過激活PPARα通路。

本研究與相關研究結果證實，油酸刺激HepG2細胞后，可增加載體蛋白B含量，建立脂肪肝細胞模型〔9〕。本文提示當過多的脂肪酸進入到肝細胞中時，合成TG能力增加，與相關研究結果一致〔10〕。本文提示OEA可明顯降低TG水平，具有解脂作用，與相關動物實驗結果一致〔11〕。OEA具有減少高濃度脂肪酸環境中脂滴形成的作用，OEA作為PPARα的內源性高效激動劑，可提高LPL的表達，從而促進TG水解，抑制SREBP-1c及ACC的表達，抑制脂肪酸再合成〔12〕，從而治療NASH。OEA還可激活下游基因SirtI和CPT-I的表達，發揮肝臟保護作用〔13〕，并抑制炎癥因子TNFα的表達，激活PPARα通路，達到治療目的。

1 劉 波，吳小翎，張 霞，等.福辛普利對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝纖維化的作用〔J〕.第三軍醫大學學報，2012;34(16):1646-50.

2 孟祥嵐，鄒 軍，張 樂，等.油酰乙醇胺對脂多糖誘導的THP-1細胞炎癥因子表達的影響〔J〕.中國生化藥物雜志，2012;33(2):101-5.

3 李 瓊，曾 丹.脂肪肝與高血壓、高血糖、高血脂、超重的相關性〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(23):4530-2.

4 候舒艦，吳 丹，蔣卓勤，等.染料木黃酮對油酸誘導脂肪變HepG2細胞PPARα表達和糖脂水平的影響〔J〕.營養學報，2014;36(1):49-52.

5 Kojonazarov B，Luitel H，Sydykov A，et al.The peroxisome proliferator-activated receptor β /δ agonist GW0742 has direct protective effects on right heart hypertrophy〔J〕.Pulm Circ，2013;3(4):926-35.

6 Lee CH，Won MH.Change of peroxisome proliferator-activated receptor γ expression pattern in the gerbil dentate gyrus after transient global cerebral ischemia〔J〕.Anat Cell Biol，2014;47(2):111-6.

7 張文亮.運動對ApoE基因敲除小鼠骨骼肌PPAR-α及脂代謝的影響〔D〕.長沙:中南大學，2011.

8 陳 博.PPAR-α激動劑油酰乙醇胺對高脂血癥大鼠降血脂及肝臟保護作用的研究〔D〕.廈門:廈門大學，2011.

9 廖俊蕾，趙 蕾，陳 曜，等.沉默膽固醇調節原件結合蛋白2基因對炎癥因子所致HepG2細胞內膽固醇異常積聚的影響〔J〕.中華肝臟病雜志，2012;20(7):526-31.

10 吳昌維，陳荔萍，艾羅燕，等.HepG2脂肪變模型中氧化應激的發生及維生素 E對其的干預作用〔J〕.中華消化雜志，2014;34(2):109-13.

11 陳 博，沈燕慧，盧 偉，等.油酰乙醇胺對高脂血癥大鼠降血脂及肝臟的保護作用〔J〕.中國生化藥物雜志，2011;32(5):374-7.

12 Karimian Azari E，Ramachandran D，Weibel S，et al.Vagal afferents are not necessary for the satiety effect of the gut lipid messenger oleoylethanolamide(OEA)〔J〕.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2014;14(5):167-8.

13 Fidaleo M，Fanelli F，Ceru MP，et al.Neuroprotective properties of peroxisome proliferator-activated receptor alpha(PPARα)and its lipid ligands〔J〕.Curr Med Chem，2014;21(24):2803-21.