熒光光譜法測定大鼠肝組織中丙二醛含量的方法改進

趙 穎 朱寶亮 李冬芹 宋曉雯 李慶周 范晴晴 (濟寧醫學院生物科學系，山東 日照 276800)

研究表明，脂質過氧化作用在許多疾病發病機制中起著一定作用〔1，2〕。丙二醛(MDA)是機體內的氧自由基攻擊生物膜中不飽和脂肪酸形成的脂質過氧化物，它能使DNA、膜蛋白、酶等發生交聯反應，增加膜通透性，導致細胞膜結構、功能和代謝發生改變，對機體造成損傷甚至死亡〔3〕。對MDA的準確測定可反映機體內脂質過氧化的程度，從而指導人們對機體的受損程度或耐受程度進行正確的評價，有助于醫學、生物學、藥理及工農業生產的發展〔4〕。目前MDA測定方法主要有分光光度法〔5〕，熒光法〔6〕，HPLC 法〔7〕，GC-MS 法〔8〕，試劑盒法。HPLC法、GC-MS由于儀器昂貴而難以普及;試劑盒法對多個樣品測定不經濟;分光光度法雖然操作簡便，但是測量結果不精確。本文采用一般實驗條件可操作的硫代巴比妥酸(TBA)熒光分光光度法。由于肝臟中含有本底的干擾〔9，10〕，因而本文對熒光法微量精確測定肝臟MDA的實驗條件及相關試劑進行了改進，測量正常和高脂的大鼠肝臟中MDA的含量，以期找到適用于一般實驗室對肝組織MDA含量微量差異的測定方法。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 0.9%生理鹽水，丙酮，5%三氯乙酸，95%乙醇，無水乙醇，1%硫酸，硫代巴比妥酸(TBA，98%，北京百靈威科技有限公司)，2，6，-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT，99.8%，北京百靈威科技有限公司)，1，1，3，3-四乙氧基丙烷(TEP，97%，北京百靈威科技有限公司)，正丁醇，吡啶。實驗用水為二次蒸餾水，無熒光雜質。AR1140型電子分析天平(美國奧豪斯公司)，5810(R)高速冷凍離心機(德國eppendorf公司)，恒溫水浴箱(天津艾維歐公司)，F-4600熒光分光光度計(日本日立公司)，手術剪，研缽等。

1.2動物分組及處理 選用8周齡雄性SDS大鼠12只，隨機分為對照組、高脂飲食組(HL組)，每6只一籠。飼養5 w，飼養條件參照文獻〔11〕。

1.3鼠肝勻漿的制備及去糖 大鼠禁食過夜，次日頸椎脫臼處死，開胸，剖開腹腔，用4℃生理鹽水清洗肝臟，用濾紙吸干表面水分，稱肝重，加入四倍肝臟重的0.9%的生理鹽水，在研缽中研磨成勻漿，低溫冷凍離心，3 000 r/min，15 min，取上清，轉移至另一心管，加入等體積95%的乙醇，再次低溫冷凍離心，3 000 r/min，15 min，取上清，即得去肝糖原的肝勻漿上清。

1.4MDA標準液的制備 取23.9 μl TEP于10 ml具塞試管內，用1% 硫酸稀釋至100 ml刻度，室溫放置120 min后為10 mmol/L MDA貯備液。置冰箱4℃保存備用。用水稀釋成100 μmol/L MDA溶液即為校準曲線用工作液。該溶液于5℃下貯存可穩定8 d。0測定前用水稀釋為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 的系列標準溶液。

1.5標準曲線的繪制 分別取MDA標準液200 μl置于具塞離心試管內，加入20 μl BHT(20 g/L，溶于無水乙醇)，再加入1.5 ml TBA(0.35%TBA與5%TCA以2∶1體積比在臨用前混合)，震蕩1 min，100℃水浴1 h，至冰上終止反應，加入2.5 ml正丁醇吡啶(15∶1)萃取液，充分振搖1 min，3 000 r/min離心15 min，取上清，轉移至另試管中，以激發波長為530 nm，發射波長為553 nm測定熒光強度，測量三次取平均值。此過程設置標準對照組，除置室溫替代100℃水浴外，其他條件均相同。以標準液濃度C(μmol/L)為橫坐標，以標準管與標準對照管熒光強度之差△F0為縱坐標，用最小二乘法計算得回歸方程和相關性為:Y=205.04x+27.386，R2=0.9947 ，P ＜0.001 說明線性關系良好。

1.6樣品含量的測定 除用去糖的肝勻漿替代MDA標準液外，其操作同1.4。

1.7統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行方差分析。

2結果

將 1.0 μml/L、2.0 μmol/L、3.0 μmol/L 的 MDA 標準液分別在90℃、95℃和100℃下和TBA反應。100℃時的測定值的直線斜率最大(圖1)。因此，本實驗選用100℃。

表1 兩組肝勻漿反應液熒光強度及MDA濃度(n=6)

圖1 不同溫度和濃度峰值之間的關系

3討論

本文將被測樣品和TBA呈色以后的紅色縮合物放置室溫(25℃)每隔10 min測定熒光值1次紅色縮合物在2 h內穩定。但日光直接照射可使顏色逐漸減退，因此，在實驗操作過程中應盡量避光。TBA法受到最主要的干擾因素就是組織內的可溶性糖，而肝臟中大量的肝糖原在測定時降解為葡糖糖，因而如果不去除糖原本底的干擾，就不能正確地反映機體脂質過氧化損傷的水平。由于糖原不溶于乙醇，且乙醇作為一種較為溫和的有機溶劑，本身不會對MDA含量測定產生影響，因此利用乙醇使混合物中的糖原沉淀出來。本實驗采用95%的乙醇去除肝糖原，比較除糖前后測定MDA的結果發現，除糖前的含量明顯高于除糖后的含量，平均高20%左右，而實際上高出的部分為肝臟中肝糖原所產生，測得的值并不是MDA的真實含量，從而干擾測定的準確性。

將TBA配成0.2%、0.25%、0.3%、0.35%和0.4%四種濃度，分別與10 μmol/L MDA標準液呈色，所測熒光峰高分別為1 700、1 936、2 013、2 246 nm 和 2 247 nm，說明 0.2%TBA 值明顯偏低，而＞0.35%TBA數值無明顯變化，但當TBA濃度超過0.4%時不易充分溶解，故本實驗選用0.35%TBA。TBA質量對實驗結果影響較大。本文選用北京百靈威科技有限公司樣品，為白色粉狀。配制時先將蒸餾水煮沸后再加入TBA，以減少TBA加熱時間，避免其自發水解而變為粉紅色。TBA溶液配制以后須在1個月內使用，避光放置37℃水箱可延緩沉淀析出如有少量沉淀析出時，臨用前復溶不影響檢測結果。

正丁醇和嘧啶混合溶劑在試驗中起到萃取 MDA和 TBA反應生成的粉紅色絡合物——三甲川的作用。在齊鳳菊等測定血清中MDA含量時表明正丁醇嘧啶(15∶1)混合液萃取效果較單用正丁醇好。而溶劑比影響著對其的提取率。本實驗中采用不同的溶劑比對同一樣品不同體積進行萃取，發現在溶劑比為15∶1時，測定值的直線斜率最大，故正丁醇嘧啶(15∶1)在也作為測定肝臟中MDA含量較佳試驗條件。

MDA的測定是一項研究過氧化脂質損傷的重要生化檢測指標，而作為肝臟MDA的微量差異檢測沒有一套較實用、經濟的系統方法。本文通過系列實驗對傳統的熒光硫代巴比妥酸法進行改進:分別對正常和高脂的大鼠肝組織勻漿液上清先用95%乙醇消除肝糖原的影響，再與0.35%的硫代巴比妥酸在100℃條件下反應，顯色后用正丁醇吡啶(15∶1)混合液萃取，最后用F-4600熒光分光光度計以激發波長為530 nm，發射波長為553 nm測定其熒光強度，進而計算出肝組織中MDA的含量。改進后的方法靈敏度為204.9，適用于一般實驗室對肝組織MDA含量微量差異的測定，可用于過氧化脂質損傷對肝臟影響的機制研究。

1 劉愛英，金 輝，岳海波，等.犬心肌缺血后脂質過氧化損傷及絞股藍總皂甙的干預效應〔J〕.中國老年學雜志，2013;33(15):3657-9.

2 周 滔，閆秀川，楊 珂，等.CCl4和脂多糖誘導的急性肝損傷中肝細胞凋亡病理特點比較〔J〕.中國實驗動物學報，2007;15(5):347-50.

3 趙英政，徐光翠，張利利，等.低劑量鎘誘導雄性大鼠抗氧化損傷能力的適應性反應〔J〕.現代預防醫學，2013;40(5):908-10.

4 Fattman CL，Schaefer LM，Oury TD.Extracellular superoxide dismutase in biology and medicine〔J〕.Free Radic Biol Med，2003;35(3):236-56.

5 劉仲奇，胡永芳.脂質過氧化產物-丙二醛的簡便測定〔J〕.甘肅中醫學院學報，2001;18(3):13-5.

6 Wojciech W，Jean N，Anne P.Optimized steps in fluorometricdetermination of thiobarbituric acid-reactive substances in serum:importance of ext raction pH and influence of sample preservation and storage〔M〕.Clin Chem，1993;39(12):2522-6.

7 蔣小華，謝運昌，李 娟，等.柱前衍生化反相高效液相色譜測定大鼠血漿中的丙二醛〔J〕.光譜實驗室，2013;30(2):790-4.

8 Fitzmaurice PS，Tong J，Yazdanpanah M，et al.Levels of 4-hydroxynonenal and malondialdehyde are increased in brain of human chronic users of methamphetamine〔J〕.Pharmacol Exp Ther，2006;319(2):703-9.

9 張建新.熒光法測定血清脂質過氧化物的最佳反應條件〔J〕.中華預防醫學雜志，1998;32(1):40-2.

10 劉 彬，齊 云，李 蒙，等.分光光度法與熒光法測定肝組織丙二醛含量的比較研究〔J〕.中國藥理學通報，2010;26(12):1674-7.

11 朱寶亮，趙 穎，劉 景，等.四氫生物蝶呤對大鼠低密度脂蛋白氧化修飾的作用及其機制探討〔J〕.中國應用生理學雜志，2012;28(5):449-53.

12 察冬梅.淺議靈敏度、檢出限和測定限〔J〕.大學化學，2011;26(4):84-6.