電針對局灶性腦缺血大鼠神經行為學及酪氨酸激酶JAK2的影響

劉 榮 許能貴 (廣州中醫藥大學針灸康復臨床醫學院，廣東 廣州 510006)

研究證明，腦缺血損傷引起的細胞凋亡多與白介素、腫瘤壞死因等細胞因子有關，而JAK/STAT系統可能在以上因子發生作用的信號轉導過程中的起重要作用〔1〕。JAK2作為酪氨酸蛋白激酶JAK家族的一員，參與了免疫、造血、神經等系統的信號轉導〔2〕。研究發現，腦缺血損傷后 JAK2磷酸化抑制劑AG490可以抑制JAK2的活化，下調STAT3的磷酸化水平，抑制神經元細胞凋亡，從而保護腦缺血后神經細胞以及改善神經功能缺損〔3〕。揚謙梓等〔4〕在研究兔右側大腦中動脈梗死模型中發現，與對照組相比，應用JAKs酪氨酸磷酸化抑制劑AG490可改善大鼠神經行為評分(NBS)并縮小其腦梗死面積。我們的前期研究工作已初步證實了，腦缺血后磷酸化JAK2、STAT3超量表達，JAK2-STAT3信號轉導通路異常激活;而腦缺血后電針治療可下調p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達水平，阻斷JAK2-STAT3信號轉導通路的異常激活，這可能為電針治療腦缺血損傷、抑制神經元凋亡的重要機制之一〔5～7〕。本實驗探討酪氨酸激酶JAK2在腦缺血損傷中的作用，進一步揭示電針治療缺血性腦疾病的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級SD大鼠250只，雄性，體重180～220 g，廣州中醫藥大學動物實驗中心提供，許可證號:SCXK(粵)2008-0020。將動物分為假手術組、模型組、電針組、AG490組、電針+AG490組，每組各50只，各組按造模后時間的不同分為2 h、1、3、7和21 d的5個時間段，每小組10只大鼠。

1.2主要試劑 AG490(德國Merck公司)、DMSO(美國Sigma公司)、大鼠JAK2原位雜交檢測試劑盒(針對大鼠JAK2靶基因的mRNA序列為:①5＇-GCCGC CACTG AGCAA AAAGG TAAGA CAT，②5＇-TCGCT CAACG GCAAA GGTCA GGAAG TAT)(天津灝洋生物工程有限公司)、DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司)、兔抗 p-JAK2多克隆抗體(美國 Santa公司)、山羊抗兔IgG-HRP(美國Santa公司)。

1.3主要儀器 G6805-Ⅰ型電針儀(青島鑫升廠)、華佗牌無菌針灸針(0.3 mm×25 mm，蘇州醫療用品廠)、932型電熱凝器(上海醫療器械八廠)、Leica冰凍切片機(德國Leica公司)、大鼠大腦立體定位儀(上海京工實業有限公司)、蔡司AxioCam-MR顯微鏡(德國Zeiss公司)。

1.4方法

1.4.1局灶性腦缺血模型制備 采用熱凝閉大腦中動脈致局灶性腦缺血模型。用10%水合氯醛溶液，按0.33 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠。取右側臥位固定，沿耳眼連線中點切開皮膚，分離顳肌，暴露顳骨做一骨窗，輕抬腦，顯露大腦中動脈，用932型電熱凝器輕觸大腦中動脈，使之凝閉，造成局灶性腦缺血模型。其中假手術組只手術暴露大鼠大腦中動脈，不予凝閉。

1.4.2治療方法 電針組術后給予電針治療，選取“百會”、“大椎”兩穴。兩穴接上電針，用疏密波，疏密波調制頻率為20次/min，電流強度約1～2 mA，以大鼠安靜耐受為度，時間30 min，1 次/d。

1.4.3AG490側腦室注射 將AG490溶解于3%二甲基亞砜(DMSO)溶液中。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.33 ml/100 g)麻醉后，于立體定向儀上固定門齒與兩外耳道。頭頂皮膚剃毛，消毒后切開顱頂皮膚。鈍性分離筋膜，暴露Bregma點，并以黑墨水標記。進針點位于Bregma點后0.8 mm，矢狀縫右側1.5 mm。用注射器針頭在定點上鉆孔，保證將顱骨鉆透但不傷及腦實質。消毒棉球止血，干燥術野后，將裝載有10 μl藥物的25 μl微量注射器(尖端連接玻璃電極)與立體定向儀連接，針深至腹側4.8 mm。進入側腦室后，緩慢勻速推注藥物，時間為10 min，再留針2 min。

1.5神經功能缺損評分 采用Zea-Longa的5分制評分標準進行神經功能缺損評分，其中1～4分為動物缺血模型成功的標志。具體評分標準如下:0分:無任何神經功能缺損癥狀;1分:輕微神經功能缺損，不能完全伸展對側前爪;2分:中度局灶性神經功能缺損，行走時向缺血灶對側轉圈;3分:重度局灶性神經功能缺損，站立時向缺血灶對側傾倒;4分:不能自發行走，意識喪失。

1.6JAK2 mRNA原位雜交 將冰凍切片置過氧化氫封閉液室溫20 min，以封閉內源性過氧化氫酶。0.01 mol/L PBS清洗5 min×1。滴加消化工作液，覆蓋組織表面，室溫20 min。0.01 mol/L PBS清洗5 min×3。0.2×SSC洗滌3 min×1。滴加預雜交工作液覆蓋組織37℃濕盒孵育1 h。預雜交后的洗滌-揭去蓋玻片以0.2×SSC洗滌5 min×3。滴加雜交工作液(含探針5 μg/ml)覆蓋組織37℃濕盒孵育2 h。雜交后的洗滌-揭去蓋玻片以0.2×SSC洗滌5 min×3，0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3。滴加小鼠抗地高辛生物素標記的抗體工作液，覆蓋組織37℃濕盒孵育45 min。0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3。滴加高敏過氧化物酶鏈親和素復合物工作液。覆蓋組織37℃濕盒孵育45 min。0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3。DAB顯色，光學顯微鏡下觀察至細胞內胞質陽性顏色與細胞外背景顏色對比度反差明顯時蒸餾水洗終止反應。蘇木素復染，胞核為藍色。梯度乙醇(75%、85%、95%、100%)脫水，5 min/次，二甲苯透明3 min×2，中性樹膠封片保留。應用Image-ProPluse 6.0圖像分析系統測定光密度值。

1.7統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件包進行單因素方差分析及LSD檢驗。

2結果

2.1神經功能缺損評分 見表1。假手術組大鼠各時段神經功能缺損評分均為0分。在腦缺血不同時間段方面，腦缺血1 d時各組大鼠神經功能缺損評分與其他時間段相比處于較高水平。在不同處理方面，模型組的分值最高，除21 d組外，與電針組、AG490組及AG490+電針組比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。缺血后3 d模型組大鼠神經功能缺損有所減輕，部分大鼠向病灶對側傾倒或轉圈運動，與假手術組比較有顯著差異(P＜0.01)，而電針組、AG490組和AG490+電針組大鼠神經缺損功能逐漸恢復，評分明顯低于同時間段模型組(P＜0.01)，但3組間評分比較無統計學意義(P＞0.05)。缺血7 d后，各組大鼠神經功能缺損狀況有所改善，其中電針組、AG490組和AG490+電針組大鼠神經行為學評分與同時間段模型組相比均降低(P＜0.05)。21 d后模型組大鼠神經功能缺損評分繼續下降，與假手術組比較仍有顯著差異(P＜0.01)，但模型組、電針組、AG490組和AG490+電針組之間無顯著差異(P＞0.05)。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分比較(x ± s，n=10)

2.2缺血灶大腦皮質JAK2 mRNA表達 各時段的假手術組均只有極少量JAK2 mRNA表達。缺血2 h后其他各組JAK2 mRNA水平即開始升高，與同時段假手術組相比均有顯著性差異(P＜0.01)，其中又以模型組升高最明顯，與 AG490組、AG490+電針組間差異有統計學意義(P＜0.05)。除假手術組，缺血1 d后各組均升高達到峰值，模型組最為顯著，電針組次之，AG490組及AG490+電針組也達到組內峰值。電針組、AG490組及AG490+電針組JAK2 mRNA表達比模型組顯著降低 (P＜0.01)(圖1)。各組在缺血3 d后JAK2 mRNA水平開始下降，7 d后各組均持續下降，電針組、AG490組及AG490+電針組仍明顯低于模型組 (P＜0.01)。除假手術組，到了缺血后21 d各組JAK2 mRNA表達水平差異不明顯 (P＞0.05)，見表2。

圖1 腦缺血后1 d各組局灶性腦缺血大鼠大腦缺血側皮質JAK2 mRNA表達(DAB，×400)

表2 各組大鼠JAK2 mRNA表達比較(x ± s，n=10)

3討論

JAKs激酶為JAK/STAT信號轉導系統的重要組成部分，其是許多細胞因子、生長因子的重要信號傳感器。JAKs激酶不僅在神經系統表達，也是腦缺血后的炎性反應、決定病灶區細胞凋亡進程的重要因素。

JAK2是JAK家族中較為重要的一個成員，其與STAT家族的多個成員共同構成了多條信號轉導途徑，如JAK2/STAT3、JAK2/STAT5等〔8〕。腦缺血時能引起大量細胞因子和生長因子的釋放，這些因子能夠激活JAK2的表達，從而作用于其下游因子STAT，使其磷酸化。本研究發現在局灶性腦缺血大鼠模型中再灌注6～72 h的缺血側皮質和紋狀體中，磷酸化JAK2表達增多，在腦缺血后磷酸化JAK2的陽性物質主要分布于缺血側皮質和紋狀體的小膠質細胞和巨噬細胞中。此外，腦內注射AG490可以阻止缺血后JAK2活化，并可以明顯地縮小病變區域梗死的體積和減輕細胞凋亡和神經功能的缺失〔8〕。

神經功能缺損是評價局灶性腦缺血以及缺血性腦損害最重要的終末指標之一。研究中神經行為學觀察性評分指標包括運動減少、前肢屈曲、肌力下降、身體旋轉、側傾姿勢、呼吸窘迫等，此評分標準能較客觀地分析腦缺血后神經功能障礙程度。本研究提示腦缺血后JAK2超量表達及活化在腦缺血誘導的神經元死亡中起著決定性的作用，電針治療能有效抑制JAK2的超量表達，從而阻斷JAK2誘導的信號轉導通路的異常激活，這可能為電針治療腦缺血損傷、抑制神經元凋亡的重要機制之一。對于腦缺血損傷后JAK-STAT信號轉導通路與細胞凋亡的關系及“針刺刺激-信號調節-神經自穩態啟動”的確切途經和機制是我們進一步探索深化研究的方向。

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