2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇法誘導建立潰瘍性結腸炎大鼠模型

賀海輝 沈 洪 朱宣宣 顧培青 劉亞軍 朱 磊 鄭 凱

(湖南省直中醫醫院，湖南 株洲 412000)

潰瘍性結腸炎(UC)發病多與遺傳、環境及免疫反應異常有關，病因和發病機制至今尚未被完全闡明;其病程遷延，易反復發作，嚴重影響生活質量，且有癌變傾向。但目前仍未得到與人類UC病因、發病機制、病理改變、臨床表現及病程發展完全相似的理想模型。本文采用2，4，6-三硝基苯磺酸 (TNBS)/乙醇法給予大鼠灌腸，以建立較為接近的UC研究模型。

1 材料和方法

1.1材料 健康成年雄性SD大鼠20只，體重(202±5)g，由江蘇省中醫院藥理實驗室實驗動物中心提供。5%TNBS:美國Sigma公司生產，批號080M5000，購于上海Sigma-Aldrich生物技術有限公司;10%水合氯醛:國藥集團化學試劑有限公司生產，批號20090922;無水乙醇:南京寧試化學試劑有限公司，批號20100118;大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-10酶聯免疫檢測試劑盒:美國R＆D公司產品，由上海朗頓生物科技有限公司進口分裝。電子秤(型號MODEL DS-671):上海寺岡電子有限公司產品;電子分析天平(型號FA1004):上海精密科學儀器有限公司產品;酶標儀(型號SUNRISE):瑞士TECAN公司產品;恒溫箱(型號HPX-9052MBE):上海博迅實業有限公司醫療設備廠產品;低溫冷凍離心機(型號Labofuge 400R):Thermo electron公司產品。

1.2方法

1.2.1大鼠分組及造模方法 20只大鼠隨機分成正常組、模型組，每組10只。模型組大鼠禁食不禁水24 h，10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射麻醉后，用大鼠灌胃針管由肛門輕緩插入約8 cm，緩慢推入造模液(100 mg/kg TNBS+50%乙醇0.25 ml)，保持倒立30 s后，仰臥歸籠。正常組給予相應體積的生理鹽水灌腸。

1.2.2取材 10 d后，所有大鼠禁食24 h，脫頸椎處死，迅速取出結腸，沿腸系膜緣剪開腸腔，用等滲生理鹽水漂洗腸組織，將其平鋪于冰盤上，肉眼觀察結腸大體形態。取結腸病變最嚴重處，置4%甲醛中固定后，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察組織病理學情況。

1.2.3一般情況觀察 每天觀察大鼠體重、大便(大便性狀、血便等)、進食量、精神狀態、皮毛變化、活動情況等。根據給藥結束后大鼠體重變化(較實驗開始時體重變化百分比)、大便性狀和血便情況，參照Cooper等〔1〕方法進行疾病活動指數(DAI)評分并稍作修改。體重下降:無，0分;1% ～5%，1分;5% ～10%，2分;10% ～15%，3分;＞15%，4分。大便性狀:正常大便，0分;稀糊便，2分;水樣便，4分。血便:無肉眼血便，0分;肉眼血便，4分。

1.2.4結腸大體形態損傷觀察 觀察結腸充血、潰瘍、腸壁增厚情況，參照文獻〔2〕進行結腸大體形態損傷評分。無損傷，0分;充血但無潰瘍，1分;充血且腸壁變厚，但無潰瘍，2分;有1處潰瘍但無腸壁增厚，3分;有2處或2處以上潰瘍或炎癥，4分;有2處或2處以上大潰瘍和炎癥或有1處潰瘍和炎癥沿結腸縱軸超過1 cm，5分;沿結腸縱軸損傷超過2 cm以上，每超過1 cm增加1分，6～10分。

1.2.5結腸組織病理學檢查 光鏡下觀察結腸組織病理學改變，參照文獻〔3〕進行結腸組織病理學評分。上皮細胞:正常形態，0分;有杯狀細胞丟失，1分;杯狀細胞大面積丟失，2分;隱窩細胞丟失，3分;隱窩細胞大面積丟失，4分。炎癥細胞浸潤:沒有浸潤，0分;浸潤在隱窩基底層，1分;浸潤到達黏膜肌層，2分;浸潤深入到黏膜肌層，伴隨黏膜增厚和明顯水腫，3分;浸潤到達黏膜下層，4分。

1.3統計學處理 應用SPSS10.0軟件行t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗。

2結果

2.1一般情況 正常組大鼠反應靈敏，毛發有光澤，飲食正常，無腹瀉及便血。經TNBS灌腸蘇醒后的大鼠，精神萎靡，少動，毛發雜亂無光澤，飲食量減少，出現不同程度的腹瀉及便血。處死前模型組大鼠體重〔(200.00±13.09)g〕顯著低于正常組〔(280.00±7.45)g〕(P＜0.01)。模型組大鼠 DAI評分〔(2.38±1.51)分〕明顯高于正常組(0分)(P＜0.01)。

2.2結腸大體形態損傷評分 正常組大鼠結腸大體形態正常，腸道無縮短，黏膜表面光滑、光澤，未見充血水腫、糜爛潰瘍，腸壁無增厚。模型組大鼠可見結腸腸道縮短，無粘連，腸管積氣積糞，腸黏膜表面有顆粒感、質脆，呈連續性充血水腫并可見糜爛潰瘍灶，部分大片剝脫，腸壁增厚。模型組大鼠結腸大體形態評分〔(2.94±0.94)分〕顯著高于正常組(0分)(P＜0.01)。

2.3結腸組織病理學評分 正常組大鼠鏡下觀察組織形態正常，結腸壁各層結構清晰，未見水腫、糜爛及潰瘍形成，間質少量淋巴細胞浸潤。模型組大鼠結腸組織可見黏膜層、黏膜下層廣泛潰瘍形成，大量中性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤，腺體破壞，結構紊亂，杯狀細胞減少，隱窩結構扭曲，隱窩炎癥及膿腫形成。模型組大鼠結腸組織病理學評分〔(6.00±1.67)分〕顯著高于正常組(0分)(P＜0.01)。見圖1。

圖1 各組大鼠結腸組織病理圖片(HE，×100)

3討論

TNBS與乙醇誘發大鼠結腸炎的主要機制為乙醇破壞結腸黏膜屏障，TNBS滲入結腸作為半抗原與大分子物質結合，形成全抗原引起腸壁一系列免疫應答與炎癥反應，其發病機制與人類 UC 相似〔4〕。Yoshimitsu等〔5〕報道，TNBS誘導的 SD 大鼠結腸組織干擾素(IFN)-γ升高，屬于 Th1型炎癥模型。Strober等〔6〕認為，Th1型炎癥反應以透壁性炎癥、偶伴肉芽腫形成為主，符合人類CD病理學特征。張濤等〔7〕觀察體重(200±20)g的清潔級雄性SD大鼠，給予100 mg/kg TNBS/乙醇灌腸后，可以誘導大鼠結腸炎癥伴潰瘍形成，且潰瘍主要在黏膜層，類似于人的UC病理特點。

與其他造模方法相比，采用TNBS/乙醇法建立UC模型有如下優勢:①操作簡單，不需預先致敏動物或進行外科手術，而且重現率高;②該模型的持續時間較長，體現急性炎癥及潰瘍向慢性轉化的動態過程，這一較長的病變過程對于評價藥物療效及研究急性炎癥向慢性轉化的病理變化頗為有用;③該模型組織學變化與人類UC相似，可見肥大細胞和淋巴細胞浸潤及隱窩炎和隱窩變形;④TNBS價格相對不高，實驗花費不大〔8〕。

對于UC與Th細胞亞型的關系，研究者們有不同的意見。很多人認為UC與Th2細胞密切相關〔9〕。但是有研究〔6〕認為，在人類UC雖然IL-5分泌明顯增加，IL-4卻未見明顯增加。而近來另有研究〔10〕顯示，UC是Th1和Th2共同作用的結果，在早期可能 Th1反應增強，而晚期以 Th2反應占優勢。Sawa等〔11〕通過檢測UC患者腸道各種細胞因子mRNA的擴增，發現IL-1β、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-12p40、IFN-γ 和 TNF-α 等的表達都明顯比正常組高。Melgar等〔12〕認為UC中T細胞分化成Th2、Th17及調節性T細胞。可見UC與Th細胞亞型的關系尚不明確，根據TNBS誘導的SD大鼠結腸炎屬于Th1型炎癥模型〔5〕，推斷出此模型更適于CD的研究不可靠。

綜上所述，雖然動物試驗并非是人體疾病的最好研究模型，但在目前未得到與人類UC病因、發病機制、病理改變、臨床表現及病程發展完全相似的理想模型的情況下，采用TNBS/乙醇法建立UC模型為較接近的研究模型。

1 Cooper HS，Murthy SN，Shah RS，et al.Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis〔J〕.Lab Invest，1993;69(2):238-49.

2 Luk HH，Ko JK，Fung HS，et al.Delineation of the protective action of zinc sulfate on ulcerative colitis in rats〔J〕.Eur J Pharmacol，2002;443(1-3):197-204.

3 Obermeier F，Dunger N，Strauch UG，et al，et al.Contrasting activity of cytosin-guanosin dinucleotide oligonucleotides in mice with experimental colitis〔J〕.Clin Exp Immunol，2003;134(2):217-24.

4 Morris GP，Beck PL，Herridge MS，et al.Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon〔J〕.Gastroenterology，1989;96(3):795-803.

5 Yoshimitsu M，Hayamizu K，Egi H，et al.The neutrophil/Th1 lymphocyte balance and the therapeutic effect of granulocyte colony-stimulating factor in TNBS-induced colitis of rat strains〔J〕.J Interferon Cytokine Res，2006;26(5):291-300.

6 Strober W，Fuss IJ，Blumberg RS.The immunology of mucosal models of inflammation〔J〕.Annu Rev Immunol，2002;20(5):495-549.

7 張 濤，謝建群.大鼠潰瘍性結腸炎模型的實驗研究〔J〕.中國中西醫結合消化雜志，2006;14(4):240-2.

8 王 皓，歐陽欽，胡仁偉.三硝基苯磺酸結腸炎動物模型的建立〔J〕.胃腸病學，2001;6(1):7-10.

9 Lakatos L.Immunology of inflammatory bowel diseases〔J〕.Acta Physiol Hung，2000;87(4):355-72.

10 龐艷華，鄭長青.Th1/Th2細胞亞群與炎癥性腸病的關系〔J〕.世界華人消化雜志，2004;12(8):1922-4.

11 Sawa Y，Oshitani N，Adachi K，et al.Comprehensive analysis of intestinal cytokine messenger RNA profile by real-time quantitative polymerase chain reaction in patients with inflammatory bowel disease〔J〕.Int J Mof Med，2003;11(2):175-9.

12 Melgar S，Shanahan F.Inflammatory bowel disease-from mechanisms to treatment strategies〔J〕.Autoimmunity，2010;43(7):463-77.