HIF-1α及ERCC1基因多態性與晚期非小細胞肺癌鉑類化療近期療效的相關性研究

朱明珍 徐海燕 朱志霞 蔣 華

目前，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占整個肺癌的80% ～85%，是國內發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一［1］，晚期NSCLC的主要治療手段是化療，其中鉑類(順鉑、卡鉑)是必不可少的一線治療藥物。近年來發現缺氧誘導因子-1α(Hypoxia-inducible factor 1 alph)在多種惡性腫瘤中均有表達，并與腫瘤的發生、發展、放化療抵抗及預后等密切相關［2］。近期研究表明，交叉互補基因1(excision repair cross-complementing group 1，ERCC1)表達水平的高低與多種腫瘤的鉑類耐藥相關，并發現其118位密碼子上存在C→T的多態性，此突變最終導致不同基因型的患者呈現鉑類化療療效的差異［3］。本文通過研究上述2種基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)與鉑類化療近期療效的相關性，旨在探討指導肺癌患者個體化用藥的證據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2012年1月－2014年6月連云港市第二人民醫院腫瘤內科收治的晚期NSCLC初治患者68例為研究對象，年齡≤80歲，均為連云港本市人，漢族，將研究對象的性別、年齡、吸煙情況、病理組織學類型及臨床分期等基本特征總結成表1所示。

表1 晚期NSCLC患者的臨床病理特征

所有患者均經細胞學或組織病理學確診，有經CT或MRI等掃描可測量的實體病灶。化療前血常規和肝腎功能在正常范圍內，心電圖正常，Karnofsky功能狀態(karnofsky performance status，KPS)評分均≥70分。化療前與患者簽署知情同意書，并抽取靜脈血標本2 ml裝入抗凝試管內，提取外周血基因組DNA，－20℃保存備用。

1.2 化療方案

患者均采用鉑類聯合方案:鉑類藥物有順鉑(cisplatin，DDP，25 mg/m2，d 2 ～ 5)、卡鉑(Carboplatin，CBP，AUC=5，第2天);其它聯合藥物可選擇吉西他濱(Gemcitabine，Gem，1 000 ～ 1 250 mg/m2，第 1、8 d;)、多西紫杉醇(Docetaxel，DOC，60 ～75 mg/m2，第 1 d，維持 1 h)、培美曲塞(Pemetrexed，500 mg/m2，第 1 d，維持10 min)，接受多西紫杉醇和培美曲塞化療患者常規服藥預處理。上述各方案每3～4周重復1次，2個周期后按實體瘤療效評價標準(response evaluation criteria in solid tumors，RECIST)進行療效評價。

1.3 療效評價

按RECIST進行療效評價:完全緩解(complete response，CR)，所有目標灶消失且至少維持4周;部分緩解(partial response，PR)，腫瘤最大徑之和至少縮小30%，并至少維持4周;疾病穩定(stable disease，SD)，病灶縮小未達PR或增加未到PD;疾病進展(progressive disease，PD)，病灶最大徑之和增大≥20% 或出現新病灶。參考國內外同類研究，設定(CR+PR)為有效，(SD+PD)為無效。

1.4 聚合酶鏈-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)法

1.4.1 基因組DNA的提取 用無菌抗凝真空管(乙二胺乙酸鈉抗凝負壓管)收集患者化療前一天清晨外周靜脈血2 ml，2 h內采用DNA試劑盒(購自生工生物工程上海股份有限公司)。按試劑盒上的步驟提取血液基因組DNA，所提取的DNA在紫外分光光度儀上測量OD 260/OD 280值，用以計算DNA純度與濃度。－20℃冰箱保存備用。

1.4.2 引物的設計與合成 參考 NCBI人類 HIF-1αDNA 序列，應用 Primer Desig ner 3.0.0.1 版軟件輔助設計引物HI F-1α C1772T基因序列:rs11549465-F，5 ＇GGACACAGATTTAGACTTGGAGAT 3 ＇;rs11549465-R，5＇GGTGGCATTAGCAGTAGGTTC 3＇;產物大小為187 bp。選擇文獻提供的 ERCC1基因(codon 118 Asn118Asn)引物序列:rs11615-F，5＇TCCCTATTGATGGCTTCTGC 3＇;rs11615-R，5＇TTCCTGAAGTCTGGGGTGG 3＇;產物大小為175 bp。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4.3 PCR反應體系及反應條件 50 μL PCR反應體系(均由生工生物工程股份有限公司提供):模板DNA 1 μL、上下引物各 1 μL、dNTP 10 mM 1 μL、Taq buffer 5 μL、25 mM MgCl25 μL、Taq 酶 5 U/μl 0.5 μL、水35.5 μL。反應在 Gene Amp 2700 PCR儀上進行，PCR反應條件為:95℃預變性3 min;94℃變性30 s，55℃ ～60℃退火35 s，72℃延伸40 s，共35個循環;最后72℃修復延伸5 min。

1.4.4 擴增產物的RFLP分析及鑒定基因型 限制性酶切反應。酶切反應體系 10 μL:去離子水3.5 μL，10 ×Buffer B 1 μL，HphⅠ內切酶 5U，PCR 產物 5 μL。離心機瞬時離心混勻，37.0℃水浴12～16 h。酶切條件及步驟主要參考說明書。鑒定基因型(應用PCR產物純化回收試劑盒，生工SK1141):分別取5 μL PCR產物行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，以溴化乙錠(EB)為染色劑，在1%瓊脂糖凝膠150 V、100 mA條件下，電泳20 min后，凝膠成像儀下觀察帶型，分出基因型，加以分析整理。

1.5 統計學方法

應用SPSS 12.0軟件進行數據分析，應用Logistic回歸模型分析各基因位點多態性與鉑類藥物療效的關聯性，不同基因型之間化療療效的差異采用χ2檢驗，采用Fisher精確檢驗進行計算。所有統計學檢驗均為雙側概率檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HIF-1α C1772T和ERCC1 codon 118基因型頻率

68例晚期NSCLC患者中，HIF-1α C1772T存在3種等位基因型(圖1A):C/C型占83.82%(57/68)、C/T型占16.17%(11/68)、T/T型占 0(0/68);ERCC1 codon 118也存在3種基因型(圖1B)，分別為:C/C型占 61.76%(42/68)、C/T 型占 32.35%(22/68)、T/T型占5.88%(4/68)。

圖1 PCR-RFLP法檢測HIF-1α和ERCC1基因型多態位點的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 HIF-1α和ERCC1基因的平衡檢測

對檢測的基因型分布情況應用Hardy-Weinberg定律進行遺傳平衡，HIF-1α C1772T和ERCC1 codon 118的位點檢測結果顯示，P均＞0.05，故該樣本來自同一孟德爾群體，達到了遺傳平衡，見表2。

2.3 HIF-1α C1772T和ERCC1 codon 118 SNP與鉑類化療療效的相關性

分析患者的性別、年齡、病理組織學類型及臨床分期等多項因素對晚期NSCLC患者化療療效的影響，結果顯示，以上所有因素對晚期NSCLC患者含鉑化療療效無顯著影響(P均＞0.05)。68例患者均完成2個周期化療，CR 1例，PR 21例，SD 30例，PD 16例，總有效率為32.35%(22/68)。

因兩基因攜帶T/T基因型例數均較少，故將其與C/T合并，均分組為 C/C型和 C/T+T/T型。患者HIF-1α C1772T有效組分別為:C/C型 19/57(33.33%)、C/T+T/T 型 3/11(27.27%)，化療有效率相比差異無統計學意義(P=0.694)，攜帶C/C等位基因者對化療的敏感性是T基因型的1.333倍(95%可信區間為 0.317～5.609);無效組分別為 38/57(66.67%)、8/11(72.73%)。ERCC1codon118有效組分別為:C/C型18/42(42.86%)、C/T+T/T型4/26(15.38%)，化療有效率相比差異有統計學意義(P=0.019)，攜帶C/C等位基因者對化療的敏感性是T基因型的4.125倍(95%可信區間為1.208～14.097);無效組的分別為 24/42(57.14%)、22/26(84.62%)。

表2 影響晚期NSCLC患者化療療效的臨床因素/例

進一步分析HIF-1α C1772T與ERCC1 codon 118各基因型聯合與化療療效的關系，分析結果發現同時攜帶HIF-1α C1772T C/C型及ERCC1 codon 118 C/C基因型患者化療有效組中有13例，無效組中有9例，有效率為59.09%(13/22)，與其他基因型的聯合化療總有效率［19.57%(9/46)］相比，差異有統計學意義(P=0.001)，見表 3。

表3 HIF-1α C1772T和ERCC1 codon 118 SNP與晚期NSCLC含鉑化療近期療效的關系/例

3 討論

晚期NSCLC的治療主要采用鉑類聯合三代新藥作為常用的一線化疔方案。然而，臨床研究發現，即使臨床分期及一般狀況相同、藥物使用劑量相同、不同個體對化療的敏感性仍存在很大差異，且這種差異不能用年齡及用藥等因素加以解釋，依靠傳統經驗進行治療面臨極大挑戰，因此迫切需要一種或幾種能夠預測鉑類藥物化療療效的方法，為晚期肺癌的個體化治療提供依據。

SNPs是指在個體基因組DNA序列中內頻率大于1%的單個核苷酸變異，這種變異有時導致其編碼的蛋白結構和功能發生改變，從而影響其生物學功能，在腫瘤治療領域主要表現為不同SNPs基因組患者對治療發生不同的反應。當前對于DNA修復基因ERCC1的研究較為深入并達成了共識:ERCC1陽性表達可作為鉑類耐藥的預測因子，但還不足以將其推薦作為臨床常規檢測，比如ERCC1低表達的患者接受鉑類化療后，僅有1/2左右的患者從中獲益，而相當一部分患者無法獲益，怎樣選擇能夠更受益的患者進行化療是近年來研究的重點和熱點［4］。

腫瘤的發生、發展與細胞的增殖及凋亡有關，腫瘤的缺氧是實質性腫瘤物理環境的基本特征之一，研究表明腫瘤乏氧不僅與放射治療抵抗有關，也與藥物抵抗、惡性侵襲的生物學行為及不良預后有關。實體瘤中腫瘤細胞缺氧是一種相對普遍的現象［5］，目前已知直接受HIF-1調控的基因有60余種，涉及到血管發生、紅細胞生成、能量代謝、細胞增殖和細胞凋亡、腫瘤生長和轉移以及腫瘤放化療抵抗性等多個方面［6］，其中HIF-1α起重要作用，是一個新近較受關注的因子，在大多數人類腫瘤中存在HIF-1α的過表達，現已證實該基因在多種腫瘤細胞系中均有表達，并與腫瘤的侵襲和轉移能力密切相關［2］。關于HIF-1α在患者個體之間是否存在變異，以及其自身的特點是否導致了腫瘤細胞對DNA相關細胞毒性藥物敏感性的差異，都值得深入研究。

本研究觀察68例晚期NSCLC患者的HIF-1α C1772T位點和ERCC1 codon 118位點SNP與接受鉑類藥物為主的聯合方案療效的關系，結果發現68例晚期NSCLC患者HIF-1α C1772T位點的3種基因型頻率分別為 C/C型占 83.82%(57/68)、C/T型占16.17%(11/68)，無 T/T 型。C/C 基因型 19/57(33.33%)的患者對含鉑化療的近期療效高于C/T+T/T基因型3/11(27.27%)患者，但無統計學意義(P=0.694)。ERCC1 118位點與鉑類藥物療效與國內外研究結果［7］基本相一致:ERCC1 codon 118 C/C基因型18/42(42.86%)的患者對含鉑化療的近期療效優于C/T+T/T型4/26(15.38%)，差異有統計學意義(P=0.019)。研究并發現同時攜帶HIF-1α C1772T C/C基因型和ERCC1 118 C/C基因型的化療療效與其他組合基因型相比，差異有統計學意義(P=0.001)，值得進一步研究。

本研究顯示聯合檢測HIF-1α C1772T和ERCC1 codon 118多態性對晚期NSCLC鉑類近期療效有一定的預測意義。對于晚期患者來說，組織標本往往很難獲得，本實驗是從外周血中提取DNA，較為便捷，避免了從許多未接受手術的患者處獲取組織的困難，臨床具有一定的可行性［8］。下一步我們將全組患者進行隨訪，并在今后對HIF-1α和ERCC1基因多態性與晚期非小細胞肺癌患者生存的關系方面作出評價，以便更好地指導臨床分析與治療。

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