抑制HIF1α表達(dá)對(duì)低氧培養(yǎng)SGC-7901胃癌細(xì)胞CD44表達(dá)的影響

梁 賅 杜 偉 李 爽 柯慶華 蔡 君 楊繼元

胃癌細(xì)胞表面粘附分子CD44+細(xì)胞在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的干細(xì)胞特性，如自我更新及強(qiáng)致瘤能力等［1］，提示CD44的表達(dá)在胃癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用。低氧被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞賴以生存的“小生境”(niche)的重要特性之一［2］，已知低氧對(duì)細(xì)胞的影響通過(guò)低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factors，HIF)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，主要亞型有HIF1α、HIF1β、HIF2α 等。研究表明低氧對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響主要為穩(wěn)定HIF1α亞型蛋白，抑制其蛋白降解［3］。HIF1α可調(diào)節(jié)多種靶基因如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等的表達(dá)，在胃癌細(xì)胞復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用［4］，其機(jī)制目前仍未完全明確，是否參與調(diào)節(jié)表面粘附分子CD44的表達(dá)未見研究報(bào)道。

本研究擬以人胃癌細(xì)胞系SGC-7901為研究對(duì)象，研究低氧條件下對(duì)HIF1α及CD44的表達(dá)變化，并用雷帕霉素抑制SGC7901細(xì)胞的HIF1α表達(dá)，觀察對(duì)CD44表達(dá)的影響，為闡明其分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

低分化人胃癌細(xì)胞系SGC7901購(gòu)自武漢大學(xué)典藏中心。

1.2 試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)，青霉素-鏈霉素雙抗(美國(guó)GIBCO公司)，小牛血清(GIBCO公司)，雷帕霉素(美國(guó) Sigma公司)，二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)sigma公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司);Trizol試劑(大連寶生物公司)，熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(大連寶生物公司);引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;CD44、HIF1α多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國(guó));ECL試劑盒(Pierce Biotechnology，美國(guó))。

1.3 儀器

三氣培養(yǎng)箱(德國(guó)BINDER)、RG-3000實(shí)時(shí)定量PCR儀(Corkett，澳大利亞);低溫離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó));電泳儀及電泳槽(六一儀器廠，北京)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞系 SGC7901培養(yǎng)于含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)基中，共分4組:正常及低氧空白對(duì)照;正常及低氧雷帕霉素組。分別于正常氧壓及含1%O2條件下傳代培養(yǎng)1周。隨后加入20 nm/L雷帕霉素培養(yǎng)72 h，觀察細(xì)胞活力，及生長(zhǎng)曲線的變化，并收獲細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)CD44及HIF1α的mRNA及蛋白表達(dá)。

1.4.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。將含100 μl細(xì)胞混懸液的培養(yǎng)板中，加入含20 nm/L雷帕霉素溶液10 μl，在低氧和正常氧壓中培養(yǎng)24、48、72 h，然后加入 CCK8 試劑 10 μl，混勻后培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm吸光度值。根據(jù)試劑盒方法計(jì)算細(xì)胞增殖活力。

1.4.3 Transwell試驗(yàn) Transwell試驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)胞侵襲活性。將Matrigel凝膠加入transwell小室上層，37℃孵育30 min聚合成凝膠，加入含1×105細(xì)胞懸液200 μl，放入含培養(yǎng)基的24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h。隨后取出小室，去除基質(zhì)膠及膜上層細(xì)胞，加入MTT試劑，采用間接計(jì)數(shù)法計(jì)算下室細(xì)胞數(shù)量。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)細(xì)胞CD44、HIF1α 基因mRNA的表達(dá) Trizol法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所得cDNA進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)體系見表1，引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)條件見表2，根據(jù)PCR反應(yīng)的溶解曲線及曲線特征，評(píng)價(jià)引物增殖反應(yīng)的特異性，記錄各樣本反應(yīng)的閾值(Threshold cycle，Ct)，參照試劑盒說(shuō)明書計(jì)算目的基因mRNA表達(dá)水平。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系

表2 實(shí)時(shí)定量PCR寡核苷酸引物及擴(kuò)增條件

1.4.5 Westen blot檢測(cè)細(xì)胞 CD44 及 HIF1α 蛋白表達(dá) 將上述分組培養(yǎng)的細(xì)胞去除培養(yǎng)液，加入細(xì)胞裂解液，離心后取上清進(jìn)行蛋白定量。隨后進(jìn)行SDSPAGE電泳，樣品經(jīng)過(guò)分離膠及濃縮膠，待溴酚藍(lán)至分離膠下緣時(shí)停止電泳，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將樣品蛋白濕轉(zhuǎn)至NC膜上，經(jīng)過(guò)漂洗脫色后，分別加入稀釋后的CD44及HIF1α抗體進(jìn)行一抗封閉(CD44抗體，1∶200;HIF1α抗體，1∶100)，漂洗后再加入二抗孵育，最后在暗室中進(jìn)行ECL顯色。顯色結(jié)果拍照后采用灰度分析進(jìn)行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 低氧條件下SGC7901胃癌細(xì)胞增殖活性的變化

與正常對(duì)照組對(duì)比，低氧條件下細(xì)胞增殖活性明顯升高(P＜0.05)。雷帕霉素處理SGC7901胃癌細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，不論在常氧及低氧條件下增殖活性都較對(duì)照組下降(P ＜0.05)，見圖1。

圖1 低氧條件下SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.2 低氧條件下SGC7901胃癌細(xì)胞侵襲能力的變化

與正常對(duì)照組比較，低氧條件培養(yǎng)后細(xì)胞侵襲活性明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，雷帕霉素處理后細(xì)胞侵襲活性明顯下降(P ＜0.05)，見圖2。

圖2 低氧條件培養(yǎng)SGC7901細(xì)胞侵襲活性

2.3 雷帕霉素處理人 SGC7901細(xì)胞后 HIF1α及CD44的蛋白表達(dá)

與正常對(duì)照組比較，低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞HIF1α及CD44的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，而雷帕霉素處理細(xì)胞后HIF1α和CD44表達(dá)水平均明顯降低(P ＜0.05)，見圖 3。

2.4 雷帕霉素處理人 SGC7901細(xì)胞后 HIF1a及CD44的mRNA表達(dá)

與正常對(duì)照組比較，低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞HIF1α及CD44基因的mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.01)，而雷帕霉素處理細(xì)胞后HIF1α和CD44表達(dá)均明顯降低(P ＜0.01)，見圖4。

圖3 低氧條件培養(yǎng)SGC7901細(xì)胞HIF1α及CD44的蛋白表達(dá)

3 討論

胃癌是全世界最常見的四大腫瘤之一，雖然近幾年來(lái)在美國(guó)的發(fā)生率有下降趨勢(shì)，但仍是中國(guó)及西方國(guó)家常見腫瘤疾病［5］。腫瘤干細(xì)胞(Cancer Stem Cell)假說(shuō)是近年來(lái)提出的1種新理論，假說(shuō)認(rèn)為腫瘤由腫瘤干細(xì)胞和一般腫瘤細(xì)胞組成(腫瘤的異質(zhì)性)，腫瘤干細(xì)胞是存在于腫瘤組織中的極少的具有自我更新、不定潛能性并促使腫瘤形成的細(xì)胞，是形成不同分化程度的腫瘤和腫瘤不斷生長(zhǎng)擴(kuò)散的根源［6］。因此腫瘤干細(xì)胞理論促使我們重新審視腫瘤起始、發(fā)展和治療中抗藥性及放療耐受的原因。

CD44是1種跨膜糖蛋白，為1種粘附分子。CD44+腫瘤細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中成球富集生長(zhǎng)，且注射入NOD/SCID小鼠胃中及皮下，可表現(xiàn)出極強(qiáng)的成瘤能力，表現(xiàn)出了其自我更新及分化的干細(xì)胞潛能［7］，這些提示CD44在維持其干細(xì)胞特性中起重要的作用，有學(xué)者提出將CD44作為1種胃癌腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記物，但其表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍不明確。HIF1α參與調(diào)節(jié)常見腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133的表達(dá)［8］，下調(diào)CD133過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中CD133的表達(dá)。Platet等研究表明，HIF1α可介導(dǎo)上調(diào)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞CD133的表達(dá)［9］。

本研究結(jié)果表明，低氧條件下胃癌細(xì)胞SGC7901增殖及侵襲能力明顯增強(qiáng)，下調(diào)細(xì)胞的HIF1α表達(dá)后，能有效降低SGC7901的增殖侵襲能力，并顯著降低CD44的表達(dá)。由此可推測(cè)，低氧可能通過(guò)HIF1α調(diào)節(jié)CD44的表達(dá)，調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖及侵襲潛能。而進(jìn)一步分子信號(hào)通路機(jī)制還有待后續(xù)深入研究。

圖4 低氧條件培養(yǎng)SGC7901細(xì)胞HIF1α及CD44的mRNA表達(dá)

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