應(yīng)用鏈霉素藥敏片進(jìn)行秀珍菇組織分離的研究

劉盛榮 張維瑞 朱穎萱 匡云波

（寧德師范學(xué)院生物系，福建 寧德 352100）

應(yīng)用鏈霉素藥敏片進(jìn)行秀珍菇組織分離的研究

劉盛榮 張維瑞 朱穎萱 匡云波

（寧德師范學(xué)院生物系，福建 寧德 352100）

利用不同載藥量鏈霉素藥敏片進(jìn)行秀珍菇組織分離試驗(yàn)。結(jié)果顯示：秀珍菇組織分離的細(xì)菌污染率，高達(dá)82.14%，而以放置載藥量為10 μg/片和300 μg/片鏈霉素藥敏片作為抑制細(xì)菌污染的方法，則污染率分別降至46.43%和7.14%。結(jié)論是利用鏈霉素藥敏片抑制細(xì)菌污染可有效提高秀珍菇組織分離成功率。

秀珍菇；組織分離；鏈霉素藥敏片；抑制細(xì)菌污染

秀珍菇（Pleurotus pulmonarius），是近年來發(fā)展較快的一種珍稀食用菌新品種。秀珍菇子實(shí)體單生或叢生，菌肉肥嫩，味鮮爽口，有鮮甜海鮮味，營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量比一般蔬菜高3～6倍，富含人體必需的8種氨基酸和多種維生素，特別是硒含量高，因此越來越受到人們的重視[1]。

朱堅(jiān)等[2]采用ITS-RFLP評估由臺(tái)灣引進(jìn)的秀珍菇種質(zhì)資源，發(fā)現(xiàn)36株命名為秀珍菇的菌株均為糙皮側(cè)耳和鳳尾菇。由于秀珍菇遺傳背景單一，其長遠(yuǎn)發(fā)展存在潛在隱患，因此秀珍菇菌種選育成為一重要研究課題。組織分離法是通過食用菌子實(shí)體的部分組織獲取純菌種的技術(shù)，所獲得的純菌種遺傳性狀穩(wěn)定，是選育優(yōu)良菌種的簡便有效方法[3]。

食用菌組織分離中常用75%乙醇、0.1%升汞或氣霧消毒劑對子實(shí)體或組織塊進(jìn)行消毒[4～6]，以減少污染，提高分離成功率。通過向培養(yǎng)基添加抗生素抑制細(xì)菌或真菌污染的方法也是食用菌組織分離的常用方法[7]。秀珍菇子實(shí)體小、菌柄細(xì)、菌肉薄，組織分離易受細(xì)菌污染。本研究以商業(yè)鏈霉素藥敏片作為抑制細(xì)菌污染的方法研究秀珍菇組織分離。

1 材料與方法

1.1 供試材料

于2015年6月底至8月初，從本地市場挑選新鮮、菌蓋邊緣內(nèi)卷、菌柄稍細(xì)的秀珍菇子實(shí)體作為供試的組織分離材料。

1.2 儀器及試劑

超凈工作臺(tái)、鑷子、刀片、酒精燈和培養(yǎng)皿等；載藥量為10 μg/片和300 μg/片的鏈霉素藥敏片（直徑0.5 cm）購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，自來水1 000 mL。121 ℃滅菌20 min。

1.4 試驗(yàn)方法

（1）平板制作及藥敏片放置。裝于三角瓶的PDA培養(yǎng)基經(jīng)微波爐熔化后放置于超凈工作臺(tái)上，溫度不燙手時(shí)倒入平板，每皿約15～20 mL。凝固后用鑷子夾取藥敏片放置在培養(yǎng)皿培養(yǎng)基的表面中心位置。

（2）組織分離。以75%乙醇將新鮮菇體擦拭消毒；沿菌柄對半掰至菌蓋分成兩半，露出內(nèi)部組織的一面朝上放置；用滅菌的鋒利刀片切取菌柄和菌蓋組織，使每一組織塊約為黃豆粒大小。

挑取組織塊，在離藥敏片邊緣0.5 cm處的周圍對稱放置4個(gè)，Parafilm封口膜封口，25 ℃恒溫培養(yǎng)。以不放置藥敏片的組織塊為對照。每一處理做7個(gè)平板，即28個(gè)重復(fù)。

（3）分離純化。培養(yǎng)3～7天后觀察細(xì)菌污染及菌絲萌發(fā)情況；挑取萌發(fā)組織塊尖端菌絲（含培養(yǎng)基）至斜面作為組織分離株繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)一步觀察有無細(xì)菌污染。

2 結(jié)果與分析

2.1 應(yīng)用鏈霉素藥敏片的秀珍菇組織分離效果

圖1 A為放置鏈霉素藥敏片（載藥量為300 μg/片）的組織分離培養(yǎng)菌落，B為未放置藥敏片的對照。從圖中可以看出，放置藥敏片的秀珍菇組織塊無細(xì)菌污雜，經(jīng)尖端菌絲分離，菌絲萌發(fā)生長，極少發(fā)生細(xì)菌污染，成功分離到純化菌種；未放置藥敏片的組織塊出現(xiàn)明顯細(xì)菌污染，而未觀察到菌絲萌發(fā)。由此可知，在本實(shí)驗(yàn)條件下鏈霉素藥敏片的擴(kuò)散藥物可有效抑制秀珍菇的細(xì)菌污染，提高了組織分離的成功率。

圖1 鏈霉素藥敏片組織分離菌絲生長

表1 不同載藥量鏈霉素藥敏片秀珍菇的組織分離結(jié)果

2.2 不同載藥量鏈霉素藥敏片的組織分離結(jié)果

表1顯示載藥量為10 μg/片和300 μg/片的鏈霉素藥敏片的組織分離結(jié)果。未放置藥敏片的對照細(xì)菌污染率為82.14%；利用載藥量為10 μg/片和300 μg/片鏈霉素藥敏片的組織分離細(xì)菌污染率分別下降至46.43%和7.14%?？梢婃溍顾厮幟羝瑧?yīng)用于秀珍菇食用菌組織分離可顯著提高其成功率。

3 討 論

食用菌組織分離屬無性繁殖方式，是最常用的菌種分離技術(shù)，主要用于野生菌種分離、菌種復(fù)壯以及菌種選育等。朱福錦等[8]采用組織分離法成功分離野生粗柄羊肚菌；劉曉龍等[9]利用組織分離法成功分離野生膠陀螺菌；此外，組織分離在北蟲草、野生豬芩等菌種分離上也得到應(yīng)用[10，11]?？蔓惸萚12]基于組織分離法復(fù)壯商業(yè)栽培白背毛木耳菌種，分離株菌絲生長速度提高10.3%～13.5%，產(chǎn)量提高2.7%～6.2%，污染率降低11.48%～38.55%。王波等[13]通過組織分離選育黃背木耳，產(chǎn)量提高16.48%～90.85%。

由于食藥用菌的多樣性，組織分離技術(shù)的改進(jìn)一直受到研究人員重視[6,14,15]。本研究利用放置鏈霉素藥敏片的方法抑制細(xì)菌污染，與傳統(tǒng)的直接將抗生素添加至培養(yǎng)基的方法相比，藥敏片中的藥物是通過擴(kuò)散作用釋放至培養(yǎng)基，在其周圍形成濃度梯度，離藥敏片越近，藥物濃度越高；反之，越低。該分布特點(diǎn)對呈輻射狀生長的菌絲毒性作用不斷減輕，是用于食藥用菌組織分離的一種較理想的方法。

[1] 黃毅. 食用菌栽培[M]. 北京: 高等教育出版社, 2008: 166.

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Using streptomycin-containing paper disc as a means of preventing bacteria contamination from tissue isolation of Pleurotus pulmonarius

Liu Shengrong, Zhang Weirui, Zhu Yingxuan, Kuang Yunbo
(Department of Biology, Ningde Normal University, Ningde Fujian 352100)

To simplify tissue isolation of Pleurotus pulmonarius and improve efficiency, commercial streptomycincontaining drug sensitivity paper disc (0.5 cm in diameter) was utilized for inhibiting bacteria present in the tissue isolated. Prior to isolation, one streptomycin-containing drug sensitivity paper disc was placed on the center surface of medium in a Petri dish and then tissue plugs were potted around it 0.5 cm apart. The results indicated that, out of 28 tissue plugs, 82.14% exhibited seriously bacteria contamination, while considerably decreased contamination rates as 46.43% and 7.14% were observed， respectively， when streptomycin contents of 10 μg and 300 μg of drug sensitivity paper discs were employed. From these findings, the use of drug sensitivity paper disc of streptomycin is an effective method to improve tissue isolation efficiency.

Pleurotus pulmonarius; tissue isolation; streptomycin-containing paper disc; bacteria contamination preventing

S646

A

2095-0934（2015）05-307-03

福建省科技廳引導(dǎo)性項(xiàng)目（2015N0032）；校博士啟動(dòng)項(xiàng)目（2013Y008）

劉盛榮，男，從事食用菌育種及液體深層發(fā)酵研究。E-mail：fjhost@163.com