綠原酸抗人皮膚成纖維細胞衰老的研究

陳婷 江智茂 于波 馬剛

綠原酸抗人皮膚成纖維細胞衰老的研究

陳婷 江智茂 于波 馬剛

目的探討綠原酸在乙二醛誘導的人皮膚成纖維細胞衰老中的保護作用。方法使用1 mmol/L乙二醛處理體外培養的人皮膚成纖維細胞，構建細胞衰老模型。用5、10、20、40、80 μmol/L綠原酸和乙二醛共同處理人皮膚成纖維細胞，MTT法檢測細胞增殖活性，篩選出綠原酸的有效濃度。1 mmol/L乙二醛分別與有效濃度的綠原酸（10、20、40 μmol/L）共同作用于成纖維細胞，細胞衰老β半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色法及實時熒光定量PCR法檢測衰老細胞比例和衰老基因p16INK4a mRNA的表達情況。統計分析采用單因素方差分析和LSD法。結果與空白對照組人皮膚成纖維細胞增殖（100%±6.90%）相比，乙二醛可明顯抑制細胞增殖（55.65%±2.00%），兩組差異有統計學意義（P＜0.01）。與乙二醛組細胞增殖相比，除乙二醛+5 μmol/L綠原酸組（55.36%±2.58%）外，乙二醛+10、20、40、80 μmol/L綠原酸組對細胞增殖均有不同程度地保護作用（細胞增殖率分別為60.75%±1.32%、67.65%±1.90%、75.71%±3.25%、75.69%±2.38%），呈劑量依賴性，40 μmol/L綠原酸達高峰，80 μmol/L綠原酸與40 μmol/L組相比，細胞活力的差異無統計學意義（P＞0.05），因此篩選出綠原酸的有效濃度為10～40 μmol/L。與空白對照組衰老細胞比例（13.00%±2.22%）比較，加入乙二醛后，衰老細胞明顯增多（35.65%±2.24%），差異有統計學意義（P＜0.01）。與乙二醛組細胞SA-β-gal染色陽性率相比，分別加入10、20、40 μmol/L綠原酸與乙二醛共培養后，細胞SA-β-gal染色陽性率呈劑量依賴性減少（31.50%±2.13%、22.31%±3.11%、19.32%±3.01%），差異均有統計學意義（P＜0.05）。與空白對照組衰老基因p16INK4a mRNA的表達比較，乙二醛組明顯增高（2-ΔΔCt：1.00 ± 0.06 比 0.26 ± 0.05，P＜ 0.01），分別加入 10、20、40 μmol/L 綠原酸與乙二醛共培養后表達下降（0.88±0.08、0.73±0.06、0.68±0.04，P＜0.05）。結論綠原酸在乙二醛致人皮膚成纖維細胞衰老中具有潛在的保護作用。

皮膚衰老；成纖維細胞；乙二醛；綠原酸；細胞衰老；細胞增殖；p16INK4a mRNA

皮膚衰老的本質是皮膚細胞的衰老。細胞衰老是指隨著細胞增殖代數的增多，細胞進入一個不可逆的生長停滯狀態［1］。體外實驗中，利用紫外線、乙二醛、H2O2等應激處理可以刺激細胞提前衰老，被稱為應激誘導的提前衰老［2］。具有多種藥理學作用的綠原酸是否也有延緩皮膚衰老的功能尚不清楚。本實驗利用1 mmol/L乙二醛作用于成纖維細胞，建立細胞衰老模型，通過檢測細胞衰老指標如增殖能力、細胞衰老β半乳糖苷酶（senescence associatiated-β-galactosidase，SA-β-gal）、衰老基因p16INK4a mRNA的水平，觀察綠原酸對乙二醛誘導的成纖維細胞衰老模型的保護作用。

材料和方法

一、試劑與儀器

高糖DMEM培養液（美國HyClone公司），噻唑藍（MTT）粉劑（美國Gibco公司），鼠抗人波形蛋白抗體、兔抗第8因子抗體、鼠抗角蛋白19抗體（福州邁新生物技術開發有限公司），TRIzol溶液（美國Invitrogen公司），SA-β-gal染色試劑盒（美國Millipore公司），引物［英濰捷基（上海）貿易有限公司］，綠原酸（美國Sigma公司），乙二醛［梯希愛（上海）化成工業發展有限公司］；倒置熒光顯微鏡、Leica DM4000M正置顯微鏡（德國Leica公司）。

二、體外培養人皮膚成纖維細胞及實驗分組

選取在北京大學深圳醫院泌尿外科行包皮環切術切除的兒童包皮組織進行皮膚成纖維細胞原代培養，采用酶消化法分離包皮組織，將分離所得的細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養液中培養。免疫組化法測定波形蛋白、第8因子相關抗原和細胞角蛋白19在細胞的表達情況，鑒定完畢后取生長狀況良好的3～8代成纖維細胞進行試驗。實驗分為：①空白對照組：單純用細胞培養液培養3 d，不加任何物質干預；②乙二醛損傷組：在細胞培養系中加終濃度為1 mmol/L乙二醛培養3 d，建立細胞衰老模型；③綠原酸保護組：在細胞培養系中分別加入終濃度為1 mmol/L乙二醛及5、10、20、40、80 μmol/L綠原酸共培養3 d。

三、MTT法檢測細胞增殖

按6 000個/孔將細胞接種在96孔板上，24 h后，按實驗分組加入藥物培養，3 d后加入MTT試劑，孵育4 h，棄去培養液，二甲基亞砜（DMSO）充分溶解后在酶標儀490 nm下測定A值。每組設5個復孔，重復3次實驗。相對細胞活力=處理組A值/空白對照組A值×100%。

四、SA-β-gal染色法檢測細胞衰老程度

當細胞融合達80%以上時，胰酶消化細胞，細胞爬片。按實驗分組加入藥物培養，3 d后按說明書進行SA-β-gal染色，胞質被藍染的細胞為衰老細胞，在正置顯微鏡BF模式下拍照（×200）。SA-βgal陽性率=連續4個視野的藍染細胞數/連續4個視野下細胞總數×100%。

五、qRT-PCR檢測p16INK4a mRNA表達

按1×105個/孔將細胞接種于6孔培養板中，培養24 h后，按實驗分組加入藥物，3 d后采用Trizol法提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測A260與A280，計算RNA濃度與純度，保存剩余RNA于-80℃冰箱中。按反轉錄試劑盒將提取的RNA轉錄成cDNA。實時熒光定量 RT-PCR：總反應體系（20 μl）包括反轉錄產物 cDNA 1.0 μl、熒光染料 SYBR Greenq PCR 10 μl、染料 Rox Reference Dye 和上下游引物分別 0.4 μl、dH2O 7.8 μl。將配制完成的反應液離心混勻，放入PCR擴增儀。反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性30 s，1個循環；然后57℃退火，延伸1 min，40個循環。以GAPDH為內參照基因，分析結果則使用國際通用的2-ΔΔCt法。引物序列：p16INK4a上游引物 5′-GAAGGTCCCTCAGACATCC CC-3′，下游引物 5′-CCCTGTAGGACCTTCGGTGA C-3′；GAPDH 上游引物 5′-GCACCGTCAAGGCTGA GAAC-3′，下游引物 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGG A-3′。

六、統計學分析

結 果

一、人皮膚成纖維細胞的體外培養及鑒定

鏡下見人皮膚成纖維細胞狀態良好，形態呈梭形，胞核為卵圓形。免疫組化結果顯示，細胞表達波形蛋白，第8因子相關抗原和細胞角蛋白19均未見表達。細胞形態及免疫組化的結果均顯示培養的細胞是成纖維細胞。

二、綠原酸及乙二醛對人皮膚成纖維細胞增殖能力的影響

如表1所示，各實驗組人皮膚成纖維細胞增殖能力差異有統計學意義（P＜0.05）。與空白對照組相比，乙二醛可明顯抑制細胞增殖，差異有統計學意義（P＜0.01）。與乙二醛組相比，加入5 μmol/L綠原酸對乙二醛抑制成纖維細胞的增殖沒有明顯影響；從10 μmol/L開始，綠原酸對乙二醛抑制的細胞增殖有保護作用，呈劑量依賴性，到濃度為40 μmol/L達高峰，差異均統計學意義（P＜0.05）。而80 μmol/L綠原酸與40 μmol/L綠原酸相比，細胞活力的差異無統計學意義（P＞0.05）。根據以上實驗結果，我們選用10～40 μmol/L范圍的綠原酸用于后續實驗。

三、綠原酸和乙二醛對皮膚成纖維細胞SA-βgal表達的影響

見表1，圖1。各實驗組人皮膚成纖維細胞SA-β-gal表達差異有統計學意義（P＜0.05）。與空白對照組比較，加入乙二醛后，細胞數量減少，衰老細胞明顯增多，衰老陽性率也明顯升高，差異有統計學意義（P＜ 0.01）。分別加入10、20、40 μmol/L 綠原酸與乙二醛共培養后，乙二醛誘導的人皮膚成纖維細胞衰老有不同程度的抑制，與乙二醛組相比，10～40 μmol/L綠原酸+乙二醛組細胞SA-β-gal染色陽性率呈劑量依賴性減少，差異均有統計學意義（P＜0.05），其中，以40 μmol/L綠原酸保護作用最為明顯。

表1 綠原酸及乙二醛對人皮膚成纖維細胞增殖能力、細胞衰老β 半乳糖苷酶（SA-β-gal）、p16INK4a mRNA 表達的影響（±s）

表1 綠原酸及乙二醛對人皮膚成纖維細胞增殖能力、細胞衰老β 半乳糖苷酶（SA-β-gal）、p16INK4a mRNA 表達的影響（±s）

注：n=3。a：與空白對照組相比，P ＜ 0.01；b：與乙二醛組相比，P ＜ 0.05；c：與乙二醛組相比，P ＜ 0.01；d：與空白對照組相比，P ＜ 0.05

組別 相對細胞活力（%）p16INK4a mRNA（2-ΔΔCt）空白對照組 100.00±6.90 13.00±2.22 0.26±0.05乙二醛組 55.65±2.00a 35.65±2.24a 1.00±0.06a乙二醛+5 μmol/L綠原酸組 55.36±2.58a - -乙二醛+10 μmol/L綠原酸組 60.75±1.32ab 31.50±2.13ab 0.88±0.08ab乙二醛+20 μmol/L綠原酸組 67.65±1.90ac 22.31±3.11ac 0.73±0.06ab乙二醛+40 μmol/L綠原酸組 75.71±3.25ac 19.32±3.01dc 0.68±0.04ab乙二醛+80 μmol/L綠原酸組 75.69±2.38ac - -F值 70.06 40.62 77.22 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 SA-β-gal陽性率（%）

圖1 綠原酸和乙二醛對皮膚成纖維細胞SA-β-gal表達的影響（×200） 1A：空白對照組；1B：乙二醛組，藍染細胞增多，細胞總數減少；1C～1E：分別為10、20、40 μmol/L綠原酸和乙二醛共培養組，與乙二醛組相比，藍染細胞數逐漸減少，而細胞總數逐漸增多

四、綠原酸和乙二醛對皮膚成纖維細胞p16INK4a mRNA表達的影響

見表1。qRT-PCR法檢測各組p16INK4a mRNA表達結果顯示，各組差異有統計學意義（P＜0.05）。與空白對照組比較，乙二醛可明顯增高衰老基因p16INK4a mRNA的表達（P＜0.01）。分別加入10、20、40 μmol/L 綠原酸與乙二醛共培養后，p16INK4a mRNA的表達下降（均P＜ 0.05），但 10、20、40μmol/L 組間表達差異無統計學意義（P＞0.05）。

討 論

采用應激誘導細胞提前衰老是目前研究細胞衰老及抗衰老藥物的常用方法。Sejersen 和 Rattan［2］發現，1 mmol/L乙二醛作用于皮膚成纖維細胞3 d，細胞增殖活性明顯下降，SA-β-gal表達量明顯上升，晚期糖基化終末產物（AGEs）合成增多，從而建立細胞衰老模型。這種方法不僅可以誘導成纖維細胞發生衰老改變，而且在皮膚角質形成細胞中也有同樣的發現［3］。目前利用乙二醛誘導的細胞衰老模型在抗皮膚衰老藥物的研究中得到廣泛應用［4］。其機制可能與乙二醛活躍的性質有關，其α醛基與蛋白質有高反應性，可與精氨酸、賴氨酸、半胱氨酸發生反應生成AGE，而AGE的不斷累積是導致皮膚發生衰老的重要機制之一［5-7］。

目前尚無一種特異性的標志物界定細胞處于衰老狀態，需從多角度綜合分析［8］。MTT實驗通過存活細胞數間接揭示細胞增殖能力。SA-β-gal染色實驗是判斷細胞衰老的重要方法，其原理可能與衰老細胞中溶酶體β-半乳糖苷酶表達增多有關［9］。p16INK4a是一種細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑基因，在調控細胞衰老過程中扮演關鍵作用。p16INK4a在皮膚中的含量與年齡有顯著的線性關系，其在衰老皮膚的含量是年輕皮膚的7倍［10］，因此p16INK4a也被稱為衰老基因。本實驗選用以上3種方法綜合判斷細胞是否處于衰老狀態。在本實驗中，加入乙二醛后，細胞的增殖活性明顯下降，SA-β-gal表達增多，p16INK4a mRNA表達量上升，表明乙二醛可誘導細胞衰老。

綠原酸在咖啡、水蜜桃、綠茶等食物中含量豐富，也是杜仲和金銀花的有效活性成分。但目前尚未能對綠原酸進行化學合成。國內外學者發現，綠原酸有許多生物活性，如抗氧化、抗炎、抗病毒、降血壓等［11-12］。Kim 等［13］在體外實驗中發現，綠原酸可抑制AGE合成，阻礙膠原蛋白與AGE之間交聯形成。本研究MTT實驗顯示，與乙二醛組相比，10～40 μmol/L綠原酸對細胞增殖的保護作用呈劑量依賴性，而濃度為5 μmol/L時沒有明顯效果，濃度為80 μmol/L與40 μmol/L之間差異無統計學意義。據此，我們選用10、20、40 μmol/L為后續實驗濃度。10～40 μmol/L綠原酸與乙二醛共孵育成纖維細胞后，細胞SA-β-gal陽性率均明顯低于乙二醛組，但仍高于空白對照組。p16INK4a mRNA表達情況與MTT、SA-β-gal實驗結果相似，再次證明了綠原酸對成纖維細胞的保護作用。以上結果均說明綠原酸能對抗乙二醛誘導的成纖維細胞衰老，保護細胞免受損傷，推測保護機制可能是綠原酸阻礙了乙二醛向AGE發展，減少AGE帶來的損傷。

綜上所述，利用乙二醛可以重建成纖維細胞衰老模型。在該衰老上加入綠原酸后，細胞增殖能力，SA-β-gal及p16INK4a mRNA表達均有改善，提示綠原酸在乙二醛致成纖維細胞衰老中具有潛在的保護作用。

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Inhibitory effect of chlorogenic acid on senescence of human skin fibroblasts

Chen Ting*,Jiang Zhimao,Yu Bo,Ma Gang.*Department of Dermatology,Shenzhen Maternity and Child Healthcare Hospital,Shenzhen 518000,China

ObjectiveTo evaluate the inhibitory effect of chlorogenic acid on senescence of human skin fibroblasts （HSFs）.MethodsFibroblasts isolated from human foreskin were treated with 1 mmol/L glyoxalin vitroto develop a model for cellular senescence.In order to select effective concentrations of chlorogenic acid,some HSFs were treated with 1 mmol/L glyoxal alone or in combination with chlorogenic acid at different concentrations（5,10,20,40,80 μmol/L）for 3 days,with those receiving no treatment serving as the blank control group.Then,methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）assay was performed to evaluate the proliferative activity of HSFs.Some HSFs were divided into 5 groups to be cultured alone（blank control group）,or treated with 1 mmol/L glyoxal（glyoxal group）or the combination of 1 mmol/L glyoxal and chlorogenic acid at effective concentrations of 10,20 and 40 μmol/L （glyoxal+chlorogenic acid groups）.Senescence associated β-galactosidase （SA-β-gal）staining and real-time fluorescence-based quantitative PCR were conducted to determine the percentage of senescent cells and expression level of p16INK4a mRNA respectively.Statistical analysis was carried out by one-way analysis of variance followed by the least significant difference（LSD）-ttest.ResultsCompared with the blank control group,the glyoxal group showed significantly decreased cellular proliferative activity of HSFs（55.65% ±2.00%vs.100% ±6.90%,P＜0.01）,while chlorogenic acid increased the proliferative activity of HSFs in a dose-dependent manner,and the increase reached a peak at 40 μmol/L.Concretely speaking,the glyoxal+10-,20-,40-,80-μmol/L chlorogenic acid groups all significantly differed from the glyoxal group in cellular proliferative activity（60.75%±1.32%,67.65%±1.90%,75.71%±3.25%and 75.69%±2.38%vs.55.65%± 2.00%,allP＜ 0.05）,but no significant difference was observed between the glyoxal group and glyoxal+5-μmol/L chlorogenic acid group or between the glyoxal+40-μmol/L chlorogenic acid group and glyoxal+80-μmol/L chlorogenic acid group （bothP＞ 0.05）.Therefore,10-40 μmol/L was selected as the effective concentrations of chlorogenic acid.The glyoxal group showed significant increases in the percentage of senescent（SA-β-gal-positive）cells （35.65% ±2.24%vs.13.00%±2.22%,P＜0.01）and expression level of p16INK4a mRNA （2-ΔΔCt:1.00±0.06 vs.0.26±0.05,P＜0.01）compared with the blank control group,while the glyoxal+10-,20-,40-μmol/L chlorogenic acid groups showed significantly decreased percentage of senescent cells（31.50%±2.13%,22.31%±3.11%and 19.32%±3.01%respectively）and expression level of p16INK4a mRNA （2-ΔΔCt:0.88 ± 0.08,0.73 ± 0.06 and 0.68 ± 0.04 respectively）compared with the glyoxal group （allP＜0.05）.Additionally,the percentage of senescent cells decreased with the increase in chlorogenic acid concentrations in the glyoxal+chlorogenic acid groups.ConclusionChlorogenic acid can protect HSFs from glyoxal-induced senescence.

Skin aging;Fibroblasts;Glyoxal;Chlorogenic acid;Cell aging;Cell proliferation;p16INK4a mRNA

Ma Gang,Email:szmagang@medmail.com.cn

作者單位：518000深圳市婦幼保健院皮膚科（陳婷）；北京大學深圳醫院中心實驗室（江智茂），皮膚科（馬剛、于波）

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.12.005

馬剛，Email：szmagang@medmail.com.cn

2015-09-07）

（本文編輯：周良佳 顏艷）