連花清瘟顆粒微生物限度檢查方法的研究

北京以嶺藥業有限公司（102600）李志紅 王磊 李海南 王彥彥

1 材料與儀器

樣品為連花清瘟顆粒三批，批號分別為091201、091202、091203，由北京以嶺藥業有限公司生產。

營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基、改良馬丁培養基、改良馬丁瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養基均由北京三藥科技開發公司生產，按說明書要求配制，121℃濕熱滅菌15 min，備用。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]，大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]，乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC(B)50094]，白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001]，黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC(F)98003]。

脈動真空滅菌器（XG1.G型，山東新華醫療器械股份有限公司），生物安全柜（BHC-1300ⅡA2型，蘇州凈化設備有限公司），生化培養箱（LRH-250F,上海一恒科技有限公司），霉菌培養箱（MJ-250Ⅱ型，上海一恒科技有限公司），電熱恒溫水箱（HHW21.420型，天津泰斯特儀器有限公司）。

2 預試驗[1]

按照《中國藥典》2010年版一部附錄微生物限度檢查法中的平皿法進行回收率試驗，結果金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均小于70%，其余試驗菌株的回收率均大于70%，采用培養基稀釋法進行試驗（1∶10供試液，0.2ml/皿），金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均大于70%。

采用常規法對樣品進行大腸埃希菌檢查，結果陽性菌生長良好，說明本品在該條件下對大腸埃希菌的抑制作用可以忽略。

據此，擬定本品的微生物限度檢查方法草案如下。

取本品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，振搖至供試品分散均勻，制成1∶10的供試液；細菌數采用培養基稀釋法，取1∶10的供試液1ml，等量分注于5個平皿中，每皿0.2ml；霉菌及酵母菌數采用平皿法，取1∶10的供試液1ml，注入平皿中，每皿1ml；大腸埃希菌采用常規法。

3 方法學驗證[1][4]

3.1 菌液的制備按照中國藥典2010年版一部附錄微生物限度檢查法進行。

3.2 供試液的制備

取本品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，振搖至供試品分散均勻，制成1∶10的供試液。

3.3 細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證

3.3.1 試驗組

取1∶10供試液0.2ml和枯草芽孢桿菌菌液1ml，分別注入同一平皿中，立刻傾注營養瓊脂培養基，混勻，待凝固后置30℃～35℃生化培養箱培養3天，計數。用同樣的方法對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌進行試驗。

取1∶10供試液1ml和白色念珠菌菌液1ml，分別注入同一平皿中，立刻傾注玫瑰紅鈉培養基，混勻，待凝固后置23℃～28℃霉菌培養箱培養5天，計數。

取1∶10供試液1ml和黑曲霉孢子懸液1ml，分別注入同一平皿中，立刻傾注玫瑰紅鈉培養基，混勻，待凝固后置23℃～28℃霉菌培養箱培養5天，計數。

結果見附表1。

3.3.2 菌液組

分別取上述菌液1ml，采用平皿法，測定制備好的菌液的菌數（cfu/ml），所用培養基和培養條件同3.3.1，結果見附表2。

3.3.3 供試品對照組

取1∶10的供試液1ml，等量分注于5個平皿中，每皿0.2ml，立刻傾注營養瓊脂培養基，混勻，待凝固后置30℃～35℃生化培養箱培養3天，測定其本底的細菌數。

取1∶10的供試液1ml，注入平皿中，立刻傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，混勻，待凝固后置23℃～28℃霉菌培養箱培養5天，測定其本底的霉菌及酵母菌數。結果見附表3。

3.3.4 回收率

附表1 試驗組菌落計數（cfu/皿）

附表2 菌液組菌落計數（cfu/皿）

附表3 供試品對照組菌落計數（cfu/皿）

附表4 回收率（%）

附表5 大腸埃希菌檢查結果

分別進行3次獨立試驗，結果見附表4。

結果顯示，各試驗菌的回收率均大于70%，表明該方法可以有效地減弱本品對試驗菌的抑制作用。

3.4 大腸埃希菌檢查方法的驗證

3.4.1 供試品組

取1∶10供試液10ml，加至100ml乳糖膽鹽培養基中，置30℃～35℃培養箱培養24h。

3.4.2 空白對照組

取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml，加至100ml乳糖膽鹽培養基中，置30℃～35℃培養箱培養24h。

3.4.3 試驗組

取1∶10供試液10ml，加至100ml乳糖膽鹽培養基中，再加入1ml大腸埃希菌菌液，置30℃～35℃培養箱培養24h。

分別取上述培養物0.2ml，加至含5ml4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養基試管中，置30℃～35℃培養箱培養5～24h，觀察結果。見附表5。

結果顯示，試驗組檢出大腸埃希菌，供試品組和空白對照組結果為陰性，說明該方法檢查大腸埃希菌可行。

綜上所述，草案擬定的方法可行。

4 確定的微生物限度檢查方法[6][7]

取本品10 g，加p H 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，振搖至供試品分散均勻，制成1∶10的供試液；細菌計數采用培養基稀釋法，取1∶10的供試液1ml，等量分注于5個平皿中，每皿0.2ml；霉菌及酵母菌數采用平皿法，取1∶10的供試液1ml，注入平皿中，每皿1ml；大腸埃希菌采用常規法。

5 討論

由于中成藥的成分復雜，常有抑菌性，如果不對微生物限度檢查方法進行驗證，只采用平皿法，會使結果產生較大的誤差。因此要采取適當的方法減弱供試液的抑菌性，同時對方法進行驗證，才能確保結果的可靠性。如何減弱抑菌性，在方法的選擇上可以優先考慮稀釋法，簡單可靠。離心沉淀法較為繁瑣且有局限性，故未采用。

本品供試液不能全部透過濾膜，薄膜上表面有較多殘留，不適合薄膜過濾法。本品抑菌成分復雜，也很難采用中和法。因此優先選擇培養基稀釋法，驗證的結果表明，此方法可有效消除連花清瘟顆粒的抑菌性，使微生物限度檢查結果準確可靠[2][3][5]。