小花棘豆Embellisia內生真菌原生質體的制備與再生研究

呼吉雅 盧萍 牛艷芳

（內蒙古師范大學生命科學與技術學院，呼和浩特　010022）

小花棘豆Embellisia內生真菌原生質體的制備與再生研究

呼吉雅 盧萍 牛艷芳

（內蒙古師范大學生命科學與技術學院，呼和浩特010022）

旨在獲得數目多且活力高的小花棘豆Embellisia內生真菌的原生質體，分析和探討該內生真菌原生質體制備與再生的最佳條件，為后續外源基因轉化奠定基礎。利用酶解法對制備小花棘豆Embellisia內生真菌菌絲的原生質體，研究酶解液成分、pH、溫度、滲透壓穩定劑、酶解時間及菌齡對原生質體制備和再生的影響；原生質體在TB3培養基上再生后，研究酶解時間對原生質體再生的影響。結果顯示，2.5%（W/V）lysing enzymes、2%（W/V）纖維素酶和3%（W/V）蝸牛酶3種混合酶處理，菌齡為10 d，當酶解溫度為30℃、pH5.8、1.2 mol/L MgSO4為滲透壓穩定劑，在80 r/min水平搖床酶解8 h時，原生質體濃度較高，達4.42×105個/mL；酶解時間6 h時再生率最高，達46.7%。

小花棘豆；內生真菌；原生質體；原生質體制備與再生

小花棘豆（Oxytropis glabra）屬于豆科棘豆屬的多年生有毒草本植物，主要分布于我國內蒙古、甘肅、新疆、陜西、青海、寧夏等地區的荒漠化草原及山地。小花棘豆生命力旺盛、適應性很強，已成為我國西部荒漠化草原優勢種群。但是牲畜采食后會引起慢性中毒，給草原畜牧業造成嚴重損失［1，2］。其有毒成分為苦馬豆素，同屬的其他植物，如甘肅棘豆、黃花棘豆中的主要有毒成分也是苦馬豆素［3，4］，它可抑制動物細胞內α-甘露糖苷酶活性，使糖代謝受阻，致使神經細胞功能紊亂，出現中毒癥狀，毒素積累到一定程度可引起死亡。苦馬豆素具有抗腫瘤活性，可抑制腫瘤細胞N-連接寡糖的合成，從而抑制其生長及擴散［5，6］。盧萍等［7-9］研究發現，小花棘豆毒性與其感染Embellisia內生真菌密切相關，該內生真菌在分類上屬于子囊菌門、腔菌綱、格孢腔菌目、格孢腔菌科、埃里磚格孢屬的絲狀真菌，體外培養該內生真菌會產生苦馬豆素。小花棘豆中的營養成分及含量與其他豆科植物和禾本科牧草相當，是一種具有潛在利用價值的牧草［10，11］。因此，深入研究該內生真菌，對于小花棘豆的治理利用、苦馬豆素微生物工業化生產等方面都有重要意義。

原生質體是外源DNA轉化、質粒轉移、病毒轉染的良好受體，再生后可表達外源基因。真菌原生質體轉化技術已得到廣泛應用［12-14］。絲狀真菌有多組分復雜細胞壁結構，與細菌、酵母、放線菌的細胞壁結構相比更加復雜，相近絲狀真菌物種間的細胞壁多糖組分和比例也不同［15-17］，絲狀真菌原生質體制備難度較高。原生質體的高效制備是完成外源基因轉化的前提，探索其制備與再生條件非常必要。分離原生質體的方法有酶解法和機械法等，其中酶解法簡便高效，因而被廣泛使用。本研究擬探索小花棘豆Embellisia內生真菌的原生質體制備與再生的最適條件，旨在為外源基因轉化和分析基因在真菌苦馬豆素代謝中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 小花棘豆Embellisia內生真菌OW7.8菌株，菌種于本實驗室保存。

1.1.2 試劑及培養基 1.2 mol/L滲透壓穩定劑：KCl，MgSO4，山梨醇，蔗糖（pH由磷酸緩沖液調制）。PDA培養基（g/L）：馬鈴薯 200、蔗糖 20、瓊脂粉20；PDB培養基（g/L）：馬鈴薯200、葡萄糖20、蛋白胨10；原生質體保存液（STC buffer）［18］：1 mol/L山梨醇、100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、100 mmol/L CaCl2；TB3原生質體再生培養基：20%蔗糖、0.3%酵母提取物、0.3%酸水解酪蛋白；雙層再生培養基：TOP培養基：TB3再生培養基中加入0.6%瓊脂；Bottom培養基：TB3再生培養基中加入1.5%瓊脂。1.1.3 酶的種類 蝸牛酶（Snailase），纖維素酶（Cellulase）購自內蒙古鴻之惠商貿有限公司；溶壁酶（Lysing enzymes）購自Sigma公司。纖維素酶4 000 r/min 離心2 min，取上清。酶溶液用1.2 mol/L滲透壓穩定劑配制，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，現用現配。

1.2 方法

1.2.1 真菌原生質體制備 在PDA平板上接種OW7.8菌株，培養15 d，用滅菌牙簽刮下菌絲體，置于50 mL PDB液體培養基中，于25℃、200 r/min震蕩培養14 d后，用寬口槍頭取出適量菌絲團置于10 mL離心管中，4 000 r/min離心5 min，棄上清，用超純水洗去殘留培養基，用滲透壓穩定劑沖洗一次。稱量得到白色菌絲團鮮重，按每克菌絲加20 mL酶液添加進行酶解反應，每隔30 min檢測原生質體釋放情況。酶解結束后，用血球計數板計數原生質體，6次重復，計算原生質體釋放率。用4層擦鏡紙過濾菌絲體酶解液，去掉殘余菌絲體，用滲透壓穩定劑沖洗一次，于4℃、6 000 r/min離心10 min，棄上清，加入0.5 mL STC buffer，再次離心后棄上清，加適量STC buffer混勻，收集純化的原生質體，用血球計數板進行計數，6次重復，得到原生質體濃度值。

1.2.1.1 酶組合及其濃度 用溶壁酶（含幾丁質酶、葡聚糖酶、纖維素酶和蛋白酶）、蝸牛酶（含葡聚糖酶、昆布多糖酶、纖維素酶和多聚半乳糖酶等20多種酶）和纖維素酶（含外切β-葡聚糖酶、內切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶），設計單酶、不同酶組合及酶濃度梯度實驗（表1）。其他條件為菌齡12 d，pH6.0，30℃，以MgSO4為滲透壓穩定劑，酶解6 h，計算原生質體釋放率，確定最佳酶濃度及酶組合。

1.2.1.2 酶解反應pH值 酶組合及濃度確定后，用磷酸緩沖液分別配制pH分別為5.5、5.8、6.1、6.4、6.7和7.0的MgSO4溶液，其他條件不變，進行酶解反應，分別計算原生質體釋放率。

1.2.1.3 酶解溫度 采用上述實驗確定的酶組合和MgSO4濃度的條件，設置酶解溫度分別為20℃、25℃、30℃和35℃，其他條件不變，進行酶解反應，分別計算原生質體釋放率。

表1 不同酶組合及濃度實驗設計

1.2.1.4 滲透壓穩定劑 采用上述實驗確定的酶組合、MgSO4濃度和溫度條件，分別以MgSO4、KCl、山梨醇和蔗糖為滲透壓穩定劑，進行酶解反應，分別計算原生質體釋放率。

1.2.1.5 酶解時間 將酶解反應時間設置在2、4、6、8和10 h，分別計算原生質體釋放率。收集原生質體，在TB3培養基上再生，于25℃恒溫培養5 d，分別計算酶解反應時間在2、4、6、8和10 h時的原生質體再生率。

1.2.1.6 菌齡 將菌絲接種到PDB培養基上，在恒溫振蕩器上以80 r/min分別震蕩培養8、10、12、14和16 d后，制備原生質體，計算原生質體釋放率。1.2.2 真菌原生質體的釋放形式 在酶解過程中，每隔30 min取樣制片，在顯微鏡下觀察原生質體的釋放。

1.2.3 原生質體再生 將收集純化的原生質體接種到雙層平板中。先在培養皿底部鋪一層Bottom培養基，待其凝固，將收集純化并用STC buffer適當稀釋的原生質體與冷卻至40℃左右的TOP培養基輕輕混勻，倒入上述平板中，于25℃恒溫培養5 d，計數再生菌落數。收集原生質體時會有酶解不完全的菌絲，為消除其對計算原生質體再生率帶來的誤差，將相同量原生質體收集液用去離子水稀釋，室溫放置20 min，使原生質體充分脹破，也以上述再生方式培養，進行計菌落數。

原生質體再生率（%）=（STC buffer稀釋生長的菌落數-去離子水稀釋生長的菌落數）/原生質體總數×100%

2 結果

2.1 影響小花棘豆Embellisia內生真菌原生質體制備的因素

2.1.1 酶組分及濃度 制備小花棘豆Embellisia內生真菌的原生質體時，3種酶的混合酶解效果明顯優于單酶及雙酶混合的效果，原生質體產量起初隨著溶壁酶濃度的增加而明顯提高，但增至3%時，原生質體產量增加不再顯著（表2）。綜合考慮酶濃度與產量比，后續實驗選擇2.5%溶壁酶、3%蝸牛酶和2%纖維素酶三種酶的混合進行酶解反應。

表2 酶的不同組合及濃度對原生質體產量的影響

2.1.2 pH值 原生質體產量隨pH增高而增多，pH5.8時原生質體產量最高，達3.33×105個/mL，之后隨pH值升高，原生質體產量下降（圖1）。

2.1.3 酶解反應溫度 原生質體產量隨著酶解反應溫度的提高而增加，當反應溫度為30℃時，原生質體產量最高，為3.75×105個/mL，之后隨反應溫度的提高，原生質體產量下降（圖2）。

2.1.4 不同滲透壓穩定劑 用4種緩沖液均可形成一定數量的原生質體，其中山梨醇和蔗糖緩沖液中的原生質體數量較少，而MgSO4滲透壓穩定劑緩沖液中的原生質體數量明顯增多，達3.83×105個/mL（表3）。

圖1 酶解pH對原生質體產量的影響

圖2 酶解溫度對原生質體產量的影響

表3 不同滲透壓穩定劑對原生質體產量的影響

2.1.5 酶解時間 酶解2 h到3 h，菌絲斷裂并膨脹，只有少數原生質體產生，之后原生質體產量隨酶解時間延長而增加，直到酶解10 h時，原生質體產量達4.5×105個/mL（圖3）。但因酶解8 h時有些許原生質體已開始破裂，故酶解10 h后不繼續檢測。

2.1.6 菌齡 菌絲團隨培養時間的延長逐漸變得致密，14 d有黑色素生成。起初原生質體產量隨著菌齡延長而增加，10 d時原生質體產量最多，達4.42×105個/mL。然而繼續延長菌齡，原生質體產量急劇下降（圖4）。

圖3 酶解時間對原生質體產量的影響

圖4 菌齡對原生質體產量的影響

2.2 原生質體釋放方式

小花棘豆Embellisia內生真菌釋放原生質體的方式有頂端釋放、側位釋放和原位釋放3種（圖5）。頂端釋放和側位釋放多發生在酶解反應初期，在菌絲體細胞壁較薄處出現孔洞，原生質體從此溢出。原位釋放發生在酶解后期，菌絲段整個在原位形成球狀體，單個或數個呈串珠狀排列。

2.3 原生質體的再生

小花棘豆Embellisia內生真菌的原生質體在TB3再生培養基上生長良好。原生質體再生率與酶解反應時間的關系，見圖6。酶解2 h時原生質體產量甚少，隨酶解反應時間延長，再生率明顯提高，酶解6 h時再生率最高，達46.7.3%，繼續延長酶解反應時間，再生率下降。

圖5 原生質體釋放方式及收集純化的原生質體

圖6 酶解時間對原生質體再生率的影響

3 討論

研究發現制備絲狀真菌的原生質體時，混合酶的使用效果明顯好于單一酶［19-21］，本研究結果也支持該結論，小花棘豆Embellisia原生質體產量在一定范圍內與酶濃度成正比，超過該濃度后，產量增加不明顯，過高酶濃度則影響后續轉化及再生［22，23］。

一些研究認為，制備原生質體的酶解反應時間超過3 h，原生質體產量開始下降，再生率降低［15，21］。然而本研究的酶解反應達10 h，原生質體數量依然增加，但酶解反應8 h后，一些原生質體已開始破裂，再生率下降；培養的內生真菌的菌齡超過一定時間后，其原生質體產量也明顯下降，可能因為幼齡菌絲細胞壁成分及結構較簡單，隨菌齡增加，則細胞壁結構變得復雜化，且細胞開始分泌色素及其他次生代謝物質，影響了酶解反應效果，也可能降低了酶活性，從而使原生質體數量減少［24，25］。

原生質體再生率隨原生質體濃度增加而提高，有些原生質體無再生能力，其原因一方面可能是在形成過程中內部物質分配不均勻，導致出現缺乏細胞核或其他細胞質物質，使原生質體無法再生；另一方面可能是原生質體酶解過于徹底，喪失了再生基礎或原生質體在酶解過程中受到損傷［26，27］。

內生真菌如果培養在PDA液體菌絲培養基中，則獲得的菌絲緊密抱團，不利于酶解反應進行和釋放原生質體，且菌絲生長也比較緩慢。而在PDB培養基中真菌生長旺盛且菌絲團松散，菌絲體量足，即便不對菌絲體進行預處理也能獲得數目較多的原生質體。本研究結果為后續外源基因的轉化于表達奠定了良好的基礎。在本次對該菌原生質體制備與再生條件優化基礎上可進一步進行外源基因轉化研究。

4 結論

不同酶解液成分、pH、溫度、滲透壓穩定劑、酶解時間及菌齡對小花棘豆Embellisia內生真菌原生質體產量有顯著影響，各影響因子的最優條件組合可獲得數目較多的原生質體。酶解時間顯著影響原生質體再生率，酶解8 h時，獲得的原生質體數量及其再生率均較高，故確定最佳酶解時間為8 h。

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（責任編輯李楠）

Preparation and Regeneration of Protoplasts Isolated from Embellisia Fungal Endophyte of Oxytropis glabra

Hu Jiya Lu Ping Niu Yanfang
（College of Life Science and Technology，Inner Mongolia Normal University，Hohhot010022）

The aim of this research is to obtain more active and larger amount of protoplasts of Embellisia fungal endophyte from Oxytropis glabra， investigate the optimal conditions of protoplast preparation and regeneration， and lay foundation for setting up later exogenous gene transformation system. The protoplasts are made by enzymes， and the influences on protoplast yield regarding different combined enzymes and their concentration， pH， temperatures， osmotic solutions， enzymolysis time and hyphal culture time were discussed. The protoplasts regenerated on TB3 medium were analyzed for understanding the impacts of different enzymolysis time on the regeneration. The protoplast concentration reached to 4.42×105/mL when medium mass was hydrolyzed by enzymes consisting of 2.5%（W/V）lysing enzymes， 2%（W/V）cellulose and 3%（W/V）helicase， the culture time was 10 days， the enzymolysis temperature was set to 30℃， the pH was 5.8， the 1.2 mol/L MgSO4solution was selected as osmotic stabilizer and the cultures were incubated in a flat shaker（80 r/min）for 8 h. The protoplast regeneration rate reached to 46.7% when enzymolysis time was 6 h.

Oxytropis glabra；fungal endophytes；protoplast；preparation and regeneration

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.021

2014-11-24

國家自然科學基金項目（30860049，31460235）

呼吉雅，女，碩士研究生，研究方向：植物及真菌分子生物學；E-mail：hujiya@yeah.net

盧萍，女，博士，教授，研究方向：植物及真菌分子生物學；E-mail：luping@imnu.edu.cn