高粱SbGABA-Ts基因的克隆、原核表達(dá)及純化

楊澤偉王龍海朱莉汪海黃大昉郎志宏

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽(yáng)　621010；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京　100081）

高粱SbGABA-Ts基因的克隆、原核表達(dá)及純化

楊澤偉1，2王龍海1，2朱莉2汪海2黃大昉2郎志宏2

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽(yáng)621010；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081）

植物中GABA（γ-氨基丁酸）代謝與植物生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)傳遞及逆境響應(yīng)等過(guò)程密切相關(guān)，而參與GABA代謝的關(guān)鍵酶GABA-T（γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶）在重要農(nóng)藝作物中的研究相對(duì)滯后。利用同源性分析在高粱基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得兩個(gè)γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（SbGABA-T）基因，RT-PCR方法進(jìn)行基因克隆，并連入原核表達(dá)載體pET28a（+），轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）進(jìn)行基因異源表達(dá)分析。結(jié)果表明，包含SbGABA-T編碼區(qū)全長(zhǎng)的融合蛋白主要在包涵體中表達(dá)，而去除了SbGABA-T N端信號(hào)肽的融合蛋白以部分可溶的形式存在。進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)條件，IPTG濃度為1 mmol/L時(shí)，16℃低溫誘導(dǎo)18 h，即可獲得大量可溶性融合蛋白。用帶His標(biāo)簽的鎳柱對(duì)融合蛋白進(jìn)行了純化。

高粱GABA-T；原核表達(dá)；純化；信號(hào)肽

作為糧飼能兼用的作物，高粱［Sorghum bicolor（L.）Moench］對(duì)全球農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的貢獻(xiàn)日益顯現(xiàn)［1］。按年產(chǎn)量計(jì)算，高粱是世界上第五大重要的谷類(lèi)作物，僅次于玉米、小麥、水稻和大麥（http：// www.fao.org）。更值得注意的是，高粱具有其他作物無(wú)法比擬的多重抗逆性，在雨水稀少的美國(guó)南部平原和非洲東北部，以及中國(guó)東北和新疆廣闊的干旱

鹽堿地都有廣泛的種植。目前，已完成對(duì)美國(guó)優(yōu)良高粱自交系BTx623的測(cè)序［2］。高粱基因組的高密度遺傳圖譜、表達(dá)圖譜及基因功能鑒定等研究［3］，為玉米、小麥、大麥等禾谷類(lèi)作物基因組研究提供極有價(jià)值的信息，是禾谷類(lèi)作物的一個(gè)模式基因組。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于動(dòng)植物和各種微生物體內(nèi)，其合成與代謝通過(guò)TCA循環(huán)的一個(gè)旁路，即GABA旁路進(jìn)行［4］。研究表明，GABA旁路途徑能通過(guò)調(diào)節(jié)胞質(zhì)pH、碳氮代謝、蛋白質(zhì)降解、激素合成、活性氧形成、多胺代謝、信號(hào)傳遞等重要生理過(guò)程，繼而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成及脅迫應(yīng)答［5-7］。

γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（GABA-T）是GABA分解代謝中的第一步關(guān)鍵酶。較之哺乳動(dòng)物和微生物，植物中GABA-T基因的研究相對(duì)滯后。最近幾年，相繼從擬南芥、番茄、水稻中克隆到GABA-T基因，這些研究表明，GABA-T基因在亞型數(shù)量、亞細(xì)胞定位、組織發(fā)育豐度等各方面，隨植物種類(lèi)的變化而表現(xiàn)出較大的差異，對(duì)脅迫的響應(yīng)也不盡相同［8-10］。干擾GABA-T基因的表達(dá)，擬南芥gaba-t/pop2突變體花粉管發(fā)育異常、種子產(chǎn)量降低，對(duì)鹽脅迫的耐受力下降［11］；番茄（Solanum lycopersicum L.）SlGABA-TRNAi轉(zhuǎn)基因植株后代出現(xiàn)嚴(yán)重的矮化和不育［12］；利用GABA-T專(zhuān)一性抑制劑vinyl-GABA（VGB）處理甘藍(lán)幼苗，其主根長(zhǎng)度減少了約44%［13］，這表明GABA-T對(duì)于保障GABA的正常代謝，從而維持植株正常的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答至關(guān)重要。

目前為止，有關(guān)GABA積累的確切生理學(xué)意義，及GABA旁路與其他生理進(jìn)程間相互作用的分子機(jī)制仍不清楚，需要對(duì)GABA旁路途徑中關(guān)鍵基因及關(guān)鍵環(huán)節(jié)作進(jìn)一步解析。相關(guān)的報(bào)道也多集中在擬南芥和煙草等模式植物中，在重要農(nóng)作物尤其是高粱中的研究還屬空白，關(guān)鍵的基因尚未得到克隆和鑒定，更不清楚GABA途徑是否在高粱多重抗逆性中扮演關(guān)鍵角色。本研究通過(guò)序列相似性比對(duì)和RT-PCR方法，首次從高粱基因組中克隆得到兩個(gè)候選SbGABA-T基因，將其在大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并利用鎳柱對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，旨為高粱SbGABA-T蛋白的底物活性、催化機(jī)制的研究，以及進(jìn)一步相關(guān)抗體的制備及免疫學(xué)方法的考察等奠定基礎(chǔ)，也為其他禾谷類(lèi)作物相關(guān)基因的研究提供借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 高粱［Sorghum bicolor（L.）Moench］自交系BTx623，由中國(guó)科學(xué)院植物所景海春課題組饋贈(zèng)。

1.1.2 表達(dá)菌株及質(zhì)粒載體 本研究所用菌株E. coli DH5α、BL21（DE3）pLysS、克隆載體T-easy blunt購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。表達(dá)載體pET28a（+）購(gòu)于Novagen公司。

1.1.3 工具酶及生化試劑 RNA提取所用的Trizol試劑購(gòu)于Invitrogen公司；限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Phusion高保真酶等購(gòu)自NEB公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Fermentas公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA Marker（DL5000）、Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒等均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；IPTG及其他生化試劑等購(gòu)自于Sigma公司；引物合成及測(cè)序由北京中美泰和公司完成。

1.2 方法

1.2.1 SbGABA-T基因的cDNA擴(kuò)增 以擬南芥（Arabidopsis）的GABA-T基因序列（GenBank Accession No.At3g22200）［14］在高粱全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（NC_01-2876）中進(jìn)行比對(duì)，選取序列同源性較高的基因，在線(xiàn)分析程序NEW PLACE（https：//sogo.d n a.affrc. go.jp/）、TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/serv ices/ TargetP/）、PSORT（http：//psort.hgc.jp/ form.ht m l）分析其信號(hào)肽序列［15］。利用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)開(kāi)放閱讀框（ORF）全長(zhǎng)引物（SbGABA-T表示）及去除N端信號(hào)肽后剩余區(qū)域（SbGABA-ΔT表示）的引物（下劃線(xiàn)為限制酶酶切位點(diǎn)）：

利用Trizol試劑提取高粱BTx623幼苗總RNA，并反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：98℃預(yù)變性30 s；98℃ 變性 10 s，58℃退火20 s；72℃延伸1 min，循環(huán)33次；72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收所需大小的條帶，連接至克隆載體T-easy blunt，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，選取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送公司測(cè)序。

1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，BamH I和Sac I雙酶切處理，所得片段連入相同酶切的pET28a（+）質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，涂布含卡那霉素（終濃度為50 mg/L）的LB平板。選取PCR陽(yáng)性的克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，同時(shí)送公司測(cè)序。鑒定正確的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21（DE3）pLysS中。

1.2.3 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取BL21（DE3）pLysS陽(yáng)性單菌落，接種至含卡那霉素（終濃度為50 mg/L）的液體LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，所得培養(yǎng)物按1%接種至新鮮培養(yǎng)基；37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600約0.6，加入IPTG溶液，16℃、200 r/min進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)［16，17］。設(shè)定IPTG誘導(dǎo)濃度梯度（終濃度）：0、0.25、0.5、1.0 mmol/L；及誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)梯度：10、14、18、22、34 h。分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，以確定合適的誘導(dǎo)表達(dá)條件。

按確定的優(yōu)化條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，用PBS溶液（140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，2 mmol/L PMSF，1% Triton-X-100）重懸，超聲波間歇處理破碎菌體。離心后，菌液上清與沉淀分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.4 融合蛋白的純化 按Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說(shuō)明書(shū)填充好鎳柱，平衡柱子后負(fù)載上樣（菌液上清），收集流穿液；依次用不同梯度的咪唑緩沖液進(jìn)行目的蛋白的洗滌和洗脫，分別收集洗滌液和洗脫液。緩沖液成分為：20 mmol/L Tris-HCl（pH7.9），0.5 mol/L NaCl，10 -500 mmol/L咪唑。收集的液體分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 高粱SbGABA-T基因的cDNA克隆

根據(jù)已知的擬南芥AtGABA-T基因（GenBank Accession No.At3g22200）序列，在高粱基因組中數(shù)據(jù)庫(kù)（NC_012876）中進(jìn)行Blast，獲得兩個(gè)候選GABA-T基因亞型（hypothetical protein，未注釋?zhuān)?，本研究將其分別命名為SbGABA-T1（GenBank Accession No.XM_002445162）、SbGABA-T2（GenBank Accession No.XM_002 447046），其中，SbGABA-T1位于高粱基因組第7號(hào)染色體上，編碼509個(gè)氨基酸；SbGABA-T2則位于高粱基因組第6號(hào)染色體上，編碼511個(gè)氨基酸。SbGABA-T1、SbGABA-T2與擬南芥AtGABA-T的氨基酸序列相似性分別為73.11%和72.51%，兩亞型間的相似性為78.78%，且可變區(qū)域多集中在序列N端。進(jìn)一步分析可知，其前端信號(hào)肽剪接位點(diǎn)分別在第30和第31位氨基酸位置。據(jù)此設(shè)計(jì)引物，以高粱BTx623品種cDNA為模板，分別克隆基因全長(zhǎng)序列及截去N端信號(hào)肽后剩余部分序列，如圖1瓊脂糖凝膠電泳所示，基因全長(zhǎng)大小約為1 500 bp，截去N端信號(hào)肽后大小約為1 400 bp，與預(yù)期的片段大小相符。將PCR產(chǎn)物連入克隆載體并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)序列一致，表明高粱BTx623基因組中確實(shí)存在SbGABA-T1、SbGABA-T2兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本。保守功能域分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）表明，SbGABA-T1、SbGABA-T2均隸屬于乙酰鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AAT _Ⅰ）超家族，而γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶是該家族成員之一。

圖1 RT-PCR克隆高粱SbGABA-T基因

2.2 重組質(zhì)粒pET28a（+）-SbGABA-Ts的構(gòu)建

分別將SbGABA-T1、SbGABA-T2、SbGABA-ΔT1、SbGABA-ΔT2四個(gè)片段構(gòu)建到帶有His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pET28a（+）上（圖2-A）。相應(yīng)的重組質(zhì)粒pET28a（+）-SbGABA-Ts經(jīng)過(guò)BamHⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2-B所示，酶切后表達(dá)載體大小約為5 300 bp，目的片段大小約為1 500 bp和1 400 bp，符合預(yù)期。進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果表明目的基因均位于正確的讀碼框中，表明重組質(zhì)粒pET28a（+）-SbGABA-Ts構(gòu)建正確。

圖2 重組質(zhì)粒pET28a（+）-GABA-Ts的構(gòu)建

2.3 重組蛋白pET28a（+）-SbGABA-Ts誘導(dǎo)表達(dá)

條件

將構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體利用熱激法轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株E. coli BL21（DE3）pLysS后，進(jìn)行融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，無(wú)論如何優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，如IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)等，SbGABA-Ts全長(zhǎng)融合的目的蛋白表達(dá)量均非常少，且多集中在包涵體中，無(wú)法滿(mǎn)足下一步研究需要；而截去N端信號(hào)肽后的SbGABA-△T的融合蛋白，成功實(shí)現(xiàn)在可溶性組分中高效表達(dá)（圖3）。較之未加IPTG的對(duì)照組，加有IPTG誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組在55 kD附近新增了一條蛋白條帶（圖3箭頭指示），與預(yù)期融合蛋白的分子量相符。

圖3 重組蛋白pET28a（+）-SbGABA-T1/△T1的誘導(dǎo)表達(dá)

進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)條件，以轉(zhuǎn)化pET28a（+）-SbGABA-T1重組質(zhì)粒的菌株進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)的探索，結(jié)果如圖4所示。加有IPTG的實(shí)驗(yàn)組均成功實(shí)現(xiàn)重組蛋白的表達(dá)，盡管融合蛋白在包涵體中分布較多，但菌體破碎上清中仍有明顯目的蛋白的產(chǎn)生（圖4-A）。不同濃度IPTG作用下，融合蛋白表達(dá)量的差別并不明顯，表明融合蛋白的表達(dá)量受IPTG誘導(dǎo)濃度的影響有限。相對(duì)來(lái)說(shuō)，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下的目的蛋白表達(dá)量在可溶性組分中分布最多，相應(yīng)地在包涵體中分布較少，表明1 mmol/L IPTG可以作為比較合適的誘導(dǎo)濃度。圖4-B表明，pET28a（+）-SbGABA-△T1重組蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但增加幅度有限，考慮到誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能影響融合蛋白的結(jié)構(gòu)功能，選擇表達(dá)量相對(duì)較高的18 h作為最適的誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)。

2.4 重組蛋白pET28a（+）-SbGABA-△T的純化

根據(jù)優(yōu)化的誘導(dǎo)表達(dá)條件對(duì)重組菌BL21（DE3）/ pET28a（+）-SbGABA-△T1/△T2進(jìn)行融合蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)，并利用帶His標(biāo)簽的鎳柱進(jìn)行目的蛋白的純化。如圖5-A、B所示，流穿液中目的蛋白的量明顯減少，表明目的蛋白已結(jié)合到鎳柱上，經(jīng)過(guò)梯度濃度的咪唑緩沖液洗滌后，雜蛋白被除去，最終目的蛋白在咪唑濃度為250 mmol/L時(shí)被洗脫下來(lái)，相應(yīng)的SDS-PAGE圖表明，純化的目的蛋白條帶單一，且濃度較高，能夠滿(mǎn)足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的需要。

圖4 不同IPTG濃度及不同誘導(dǎo)時(shí)間下重組蛋白pET28a（+）-SbGABA-△T1的表達(dá)

圖5 重組蛋白pET28a（+）-SbGABA-△T1/△T2的純化

3 討論

植物受各種逆境脅迫而快速積累GABA的現(xiàn)象已廣為人知［4-6］，近年的研究進(jìn)一步表明，GABA途徑在植物胞質(zhì)pH調(diào)節(jié)、碳/氮源平衡、環(huán)境脅迫應(yīng)答、植株生長(zhǎng)發(fā)育及形態(tài)建成等方面都發(fā)揮著重要的作用［5-7］。作為GABA分解代謝的關(guān)鍵基因，GABA-T對(duì)于維持GABA途徑的正常運(yùn)轉(zhuǎn)具有重要意義，而植物中相關(guān)的研究一直比較滯后。近年來(lái)，隨著擬南芥、水稻、番茄等作物中GABA-T基因相繼被克隆，GABA-T在植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答中的作用才日益清晰［8-10］。本研究首次對(duì)高粱SbGABA-Ts基因進(jìn)行了分離及原核表達(dá)分析。研究發(fā)現(xiàn)，不同于擬南芥中GABA-T基因的單拷貝，高粱中存在兩個(gè)GABA-T基因亞型，與番茄（Solanum lycopersicum L.）中相關(guān)基因亞型數(shù)量一致。GABA-T基因以基因家族形式存在，一定程度上有助于植物在干熱環(huán)境下光呼吸作用積累的乙醛酸的代謝，是植物適應(yīng)環(huán)境壓力的表現(xiàn)［8］。

多序列比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域分析表明，高粱SbGABA-T基因與已知的植物GABA-T基因的氨基酸序列相似性達(dá)到71%-88%，而且均隸屬于乙酰鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AAT_Ⅰ）超家族。但以往的研究證實(shí)，植物中GABA-T基因各亞型間的時(shí)空表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位、蛋白酶活性等不盡相同，預(yù)示著植物中GABA-T基因各亞型間生理功能上的差異［8-10］。這種結(jié)構(gòu)與功能上的保守性和差異性，確保了GABA-T基因各亞型間在各種生理過(guò)程中既能“相互協(xié)作”，又能“各司其職”，體現(xiàn)了植物相關(guān)代謝調(diào)控的靈活和巧妙［18］。

GABA-T酶活的考察是GABA-T基因原核表達(dá)后重要的研究?jī)?nèi)容之一。植物中GABA-T蛋白酶底物特異性的研究仍存在爭(zhēng)議。早期研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物、真菌、原核生物中的GABA-T多以α-酮戊二酸作為氨基受體［13］，而植物體內(nèi)GABA-T則表現(xiàn)出丙酮酸和α-酮戊二酸兩種活性［19］。但植物體內(nèi)酶活的研究不可避免的受到諸多因素的影響，如目標(biāo)蛋白酶提取效率低、分離困難、其他蛋白酶的干擾等［20］。對(duì)目的蛋白進(jìn)行異源表達(dá)是研究蛋白結(jié)構(gòu)和功能的有效手段。近期，Clark等［8］通過(guò)對(duì)擬南芥GABA-T體外重組表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，擬南芥中GABA-T主要以丙酮酸和乙醛酸為氨基酸受體，而非α-酮戊二酸，類(lèi)似的結(jié)果也相繼出現(xiàn)在番茄、水稻GABA-T的研究中［8-10］。植物中GABA-T酶具有乙醛酸底物活性的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步開(kāi)拓了人們關(guān)于GABA途徑的傳統(tǒng)認(rèn)知。乙醛酸作為植物光呼吸途徑的主要產(chǎn)物，表明GABA途徑可能與植物光呼吸途徑聯(lián)系［21］，由此推測(cè)，GABA-T能直接利用異檸檬酸降解而來(lái)的乙醛酸形成甘氨酸和第二個(gè)琥珀酸分子（GABA旁路中琥珀酸脫氫酶作用形成一分子琥珀酸），補(bǔ)充至TCA循環(huán)中，這有助于維持受脅迫植物在碳源不足的狀態(tài)下的能量供應(yīng)［22］。

本研究通過(guò)序列相似性比對(duì)和RT-PCR方法成功克隆到高粱兩個(gè)GABA-T基因，并利用pET28a（+）原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行基因的異源表達(dá)分析，最終獲得了大量高質(zhì)量純化的重組蛋白，蛋白濃度分別達(dá)到965.46 ng/μL和893.09 ng/μL。值得注意的是，GABA-T基因編碼區(qū)全長(zhǎng)融合的目的蛋白與去除了N端信號(hào)肽的目的蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中的差異非常顯著，前者存在于包涵體中，且表達(dá)量有限；而后者雖然在包涵體中也有大量分布，但在可溶性組分中也有明顯的表達(dá)。一種解釋是原核細(xì)胞中缺乏相關(guān)的機(jī)制對(duì)誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)前體進(jìn)行進(jìn)一步加工，而去除了N端信號(hào)肽的GABA-△T是一種更接近于植物體內(nèi)成熟的GABA-T的存在形式，這對(duì)于目的蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)量和可溶性的提高更為有益［8］。重組蛋白以可溶性形式存在，使后續(xù)的蛋白純化過(guò)程可以在無(wú)變性劑的相對(duì)溫和條件下進(jìn)行，純化后的蛋白可以最大限度地保持其空間構(gòu)象與功能，這為今后高粱GABA-T酶活的分析、相應(yīng)抗體的制備及通過(guò)免疫學(xué)方法的深入研究奠定了基礎(chǔ)，也為其他禾谷類(lèi)作物相關(guān)基因的研究提供了參考和借鑒。

4 結(jié)論

通過(guò)序列相似性比對(duì)和RT-PCR方法首次克隆得到高粱兩個(gè)GABA-T基因，保守結(jié)構(gòu)域分析表明該基因均隸屬于乙酰鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AAT _Ⅰ）超家族。利用pET28a（+）原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行基因的異源表達(dá)，表明SbGABA-T編碼區(qū)全長(zhǎng)的融合蛋白主要在包涵體中表達(dá)，而去除了其N(xiāo)端信號(hào)肽的融合蛋白以部分可溶的形式存在，且在1 mmol/L IPTG（終濃度）、16℃誘導(dǎo)條件下高效表達(dá)。經(jīng)Ni親和層析柱純化，250 mmol/L咪唑溶液洗脫，即可得到純化的融合蛋白。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning，Prokaryotic Expression of Sorghum bicolor SbGABA-Ts

Yang Zewei1，2Wang Longhai1，2Zhu Li2Wang Hai2Huang Dafang2Lang Zhihong2
（1. Southwest University of Science and Technology，School of Life Science and Engineering，Mianyang621010；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100081）

GABA is a ubiquitous four-carbon，non-protein amino acid，and has been associated with growth and development，signaling transduction，and stress response in plants. GABA transaminase（GABA-T），the enzyme responsible for the catabolism of GABA，has not been fully explored，especially in several important crops. Two putative GABA transaminase genes（GABA-T）from Sorghum bicolor were obtained based on homology analysis with the identified GABA-Ts of other plants and RT-PCR. Subsequently，the two SbGABA-T genes and corresponding N-terminal truncated SbGABA-Ts were inserted into pET28a（+）vector and individually imported into E. coli strain BL21（pLysS，DE3）. Percentage improvement of soluble recombinant proteins were showed when removing the targeting peptide sequence of SbGABA-Ts. The fusion proteins were expressed partially in soluble form after incubating for 18 h at 16℃ by adding 1 mmol/L IPTG，and purified through nickel-affinity chromatography column.

Sorghum bicolor GABA-T；prokaryotic expression；purification；signal peptide

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.015

2015-01-29

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31271790，31471558）

楊澤偉，男，碩士研究生，研究方向：植物抗逆機(jī)理；E-mail：yangzewei555@sina.com

朱莉，女，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：植物抗逆分子生物學(xué)；E-mail：zhuli01@caas.cn