基于GC-MS的阿維鏈霉菌代謝物組學研究方法的建立

郭剛 唐丹 田萍萍 石秀峰 曹鵬 高強

（天津科技大學生物工程學院　工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津　300457）

基于GC-MS的阿維鏈霉菌代謝物組學研究方法的建立

郭剛 唐丹 田萍萍 石秀峰 曹鵬 高強

（天津科技大學生物工程學院工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津300457）

基于GC-MS分析平臺，建立了阿維鏈霉菌代謝物組樣品制備過程中的菌體分離、細胞清洗、細胞淬滅及代謝物提取條件，并對阿維菌素高產菌株和野生菌株胞內代謝物組進行了初步分析。采用“冷凍離心-細胞清洗（3次）-液氮淬滅（5 min）-珠磨破壁（3個循環，每個循環48 s）-提取（氯仿∶乙醇∶水= 2∶2∶1）”的方法，可以定性和定量檢測阿維鏈霉菌胞內包括氨基酸、有機酸、脂肪酸、糖類等59種差異化合物。建立的方法能夠有效地用于阿維鏈霉菌胞內代謝物的分析。

阿維鏈霉菌；代謝物組；破壁；提取；GC-MS

阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）產生的阿維菌素是一組高效、低毒、廣譜的殺蟲抗生素，在醫藥、農業和畜牧業生產中具有良好的應用價值和廣闊的市場前景［1］。國內外學者對阿維鏈霉菌的高產機制進行了廣泛研究［2］，這些研究主要集中在基因水平和蛋白質水平，而對阿維菌素產量低、副產物濃度過高等不利表型關注不多［3-5］。對于外界環境脅迫，細胞具有非常精妙和極其復雜的調控和適應機制，不僅涉及到“上游”基因組、轉錄組和蛋白質組等水平的變化，還包括“下游”對于外界擾動更加敏感的代謝物、代謝路徑和代謝網絡等層面的變化［6］。

代謝物組學（Metabolomics/Metabonomics）是對生物體內所有相對分子質量在1 000以內的代謝物進行定性和定量分析［7］，它是繼基因組學和蛋白學之后發展起來的組學學科。其著重于全局分析和理解代謝網絡與動態調節以及代謝通路控制［8，9］。代謝物組學在定量分析系統生物學中扮演著重要的角色。在這一領域已經建立了氣質（GC-MS）、液質（LC-MS）和核磁（NMR）等檢測手段［10］。

微生物代謝物組學需要高效可靠的樣品前處理，這樣才能夠確保胞內代謝物分析的準確性［9，11］。然而，最近許多科研工作者未進行條件優化，直接使用文獻報道的樣本前處理方法。為了確保樣品準確反映生物體的特定狀態，研究合理有效的胞內代謝物提取方法顯得尤為重要。常用的方法是在細胞懸液中加冷甲醇或其他有機溶劑，瞬間停止細胞的代謝［12］。但這個方法的缺點是，在淬滅過程中有機溶劑裂解細胞導致大量胞內代謝物丟失［13］。另一種方法是將菌體從培養基中分離出來之前或之后用液氮進行淬滅［9，13，14］。代謝物提取過程中，提取方法和提取溶劑對提取物的種類和含量有較大的影響。本試驗著重研究了細胞分離過程中的細胞清洗次數、破壁方法（液氮研磨和珠磨法）、破壁次數和提取溶劑對代謝物提取的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 阿維鏈霉菌野生型（WT）和高產菌株（9-39）均由中國科學院微生物研究所提供。培養基和培養方法見文獻［15］。

1.1.2 主要試劑 甲氧基銨鹽酸鹽（色譜純）與吡啶（色譜純），天津元立化工有限公司；N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（色譜純），Alfa Aesar化學有限公司。

1.1.3 儀器與設備 Precellys 24珠磨器，法國Bertin公司；LC/MS氣相色譜-質譜聯用儀，配有7683自動進樣器與6980氣相色譜儀（GC，Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA）。

1.2 方法

1.2.1 菌體制備及淬滅 取20 mL阿維鏈霉菌發酵液8 000 r/min離心5 min，上清液-80℃凍存，用于后續分析。在離心后的細胞沉淀中加入4℃預冷的0.6% NaCl水溶液，震蕩，6 000 r/min、4℃離心5 min，取1 mL上清液-80℃凍存，用于后續分析，棄上層緩沖液保留下層細胞沉淀，反復3次，以去除細胞表面的培養基成分［16］。將清洗后的細胞置于液氮中，淬滅5 min，-80℃保存備用。

1.2.2 細胞破碎和胞內小分子提取

1.2.2.1 液氮研磨細胞破碎 將淬滅后的細胞液氮研磨20 min，至細粉狀，稱取50 mg于1.5 mL離心管中用于小分子代謝物的提取，每個取樣點取5個平行［17］。

1.2.2.2 珠磨法細胞破碎 將含有50 mg淬滅后細胞的離心管中加入1.5 g玻璃微晶，再加入1 mL預冷的提取液，混勻后珠磨處理1-3個循環（每個循環48 s），液氮凍融，每次凍2 min，重復4次，4℃、10 000 r/min離心5 min，保留上清于新的離心管中。

1.2.2.3 胞內小分子提取 液氮研磨后的樣品加入1 mL預冷的提取溶劑（60%冷乙醇溶液；4∶6的1 mmol/L富馬酸水溶液：甲醇；2∶2∶1（V/V）的氯仿∶乙醇∶水；60%沸乙醇［12，18］；60%冷甲醇溶液），渦旋1 min至勻，液氮凍融，每次凍2 min，重復4次［19］。熱乙醇法提?。?0%乙醇置于沸水浴10 min，取1 mL加入含有50 mg菌體的EP管中沸水浴5 min。細胞提取液10 000 r/min離心5 min，保留上清于新的離心管中。

1.2.3 樣品的衍生化 將上述提取液冷凍干燥后，加50 μL甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液（20 mg/mL），充分溶解樣品，置于40℃水浴中，反應80 min；（2）加80 μL N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺，混合均勻，置于40℃水浴中，反應80 min；（3）將衍生后的樣品10 000 r/min離心5 min；取上清液100 μL加入進樣瓶中，并編號，于室溫放置2 h，準備進行GC-MS檢測。

1.2.4 GC/MS檢 測 GC條 件［17］：Agilent HP5 30 m×0.25 mm×0.25 μm毛細管柱；進樣口溫度：280℃，升溫程序：初始溫度70℃保持2 min，以5℃/min程序升溫至290℃保持5 min；載氣：高純氦氣，恒壓模式91 kPa，流速1 mL/min；進樣量1 μL；柱后分流比10∶1。

MS條件［17］：接口溫度：280℃；電離方式：EI；電離方式：電子轟擊電離（EI+）；離子源溫度：250℃；電子轟擊能量：70 eV；電子電流：40 μA；掃描質量范圍：50-800 m/z。

1.2.5 數據處理 將GC/MS數據導入MSD增強型化學工作站，提取離子峰并用NIST08數據庫進行比對進行定性，通過將所有的離子峰與內標物質的峰面積相比使數據歸一化，再對數據進行中心化后導入SIMCA軟件進行PCA分析［7，20］。

2 結果

2.1 菌體清洗

代謝物組研究過程中樣品的制備是非常重要的，胞內代謝物組的研究過程中必須清洗菌體去除培養基成分。但細胞清洗過程中也存在胞內物質泄漏。因此選擇合適的清洗劑和恰當的清洗次數非常重要。為了確定最恰當的清洗次數，GC-MS測定發酵液上清和4步清洗后的上清液。結果發現3步清洗可以將胞外代謝物和培養基成分完全去除（圖1）。

圖1 菌體清洗效率

2.2 細胞破碎

阿維鏈霉菌屬于革蘭氏陽性菌，使用有機溶劑無法將其細胞壁有效破碎，因此在提取胞內物質之前需要通過必要的機械方法來破壞細胞壁。液氮研磨法和珠磨法是常用的細胞膜破碎方法，這兩種方法可以在不引入其他物質的前提下達到破碎的目的。

本研究分別利用這兩種破壁方法提取胞內物質，GC-MS檢測胞內成分，數據經過歸一化和標準化導入SIMCA進行PCA分析（圖2）。從得分圖（圖2-A）中可以看出液氮研磨法和珠磨法提取的胞內物質存在明顯的差別，液氮研磨法在得分圖中比較分散，說明液氮研磨法組內誤差較大，這主要是由于人工研磨樣品不均一所致。從得分圖（圖2-B）對應的載荷圖中可以看出，液氮研磨法和珠磨法主要的差別體現在17種物質的提取效率上，對比這17種物質相對峰值（圖3）可知，珠磨法提取的物質相對量遠大于液氮研磨法。

代謝物組研究過程中胞內物質的提取過程嚴重影響代謝分析的結果，為了研究珠磨法破壁效率，GC/MS測定珠磨1-3個循環的胞內提取物并進行PCA分析，將引起差異的主要物質進行比較，結果（圖4）發現隨著珠磨次數的增加，提取的胞內物質的量增加，但到3個循環時有部分物質的提取量下降，因此確定珠磨兩個循環為最優。

2.3 胞內代謝提取

代謝物組數據分析過程中，需要定性和定量盡可能多的物質來全面的描述代謝途徑、代謝調節及描述機制。阿維鏈霉菌胞內代謝產物GC/MS可檢測到的多達300多種，而這些物質在同一溶劑中的溶解度不同。合適的萃提溶劑要求在提取過程中不能對代謝物進行物理或者化學修飾，而且要盡可能多的提取代謝物。因此進行試驗和比較不同的提取劑對阿維鏈霉菌的胞內代謝產物的提取是非常必要的。試驗中比較的5種溶劑，見表1。

編號　　溶劑組成A 60%冷乙醇溶液B 1 mmol/L富馬酸水溶液：甲醇=4∶6 C氯仿∶乙醇∶水 = 2∶2∶1 D 60%沸乙醇E 60%冷甲醇

通過以上各種提取溶劑對阿維鏈霉菌代謝物的比較（圖5）可以明顯看出提取液C除了有3個相對峰值（乳酸、脯氨酸、亮氨酸）低于60%冷甲醇提取，其他峰值均明顯高于對照，因此2∶2∶1（V/V）的氯仿∶乙醇∶水更適合作為阿維鏈霉菌胞內代謝物組的提取溶劑。

2.4 阿維鏈霉菌代謝物組分析

在建立了鏈霉菌代謝物組學研究方法后，為解析阿維鏈霉菌高產阿維菌素的機制，本研究對阿維鏈霉菌野生型（WT）和高產型（9-39）代謝物組進行了分析。

通過得分圖（圖6-A）可以看出WT和9-39胞內代謝物存在明顯的代謝差異。從載荷圖（圖6-B）可知，阿維鏈霉菌培養到第10天，9-39與WT胞內物質的主要差異來自糖類和部分氨基酸，9-39胞內半乳糖、葡萄糖和纖維二糖水平高于WT，這與蛋白組學研究結果相一致［21］。此外，蛋白組學研究發現阿維鏈霉菌高產菌株的糖代謝相關酶表達量高于野生菌株。本研究中高產菌株氨基酸類中的亮氨酸、丙氨酸、絲氨酸與賴氨酸代謝水平較高，這也與蛋白組學相關結果一致［21］。

圖2 液氮研磨法與珠磨法細胞破碎提取物PCA分析得分圖（A）和載荷圖（B）

圖3 液氮研磨法和珠磨法細胞壁破碎效率的比較

圖4 珠磨循環對胞內物質提取效率的影響

圖5 不同提取溶劑對提取效果的影響

3 討論

阿維鏈霉菌作為阿維菌素的生產菌株，其代謝工程與合成生物學改造對進一步提高阿維菌素產量具有重要意義。在改造過程中，代謝物組學作為一種系統的研究手段，在目的產物相關代謝物的發現中具有無與倫比的優勢。近年來，在微生物代謝物組學研究方面取得了巨大的進步，但尚無阿維鏈霉菌代謝組學研究方法的文獻報道，而現存的代謝物組學研究方法中沒有一種可以適用于所有微生物。這就要求人們在制備準確反映細胞生理狀態的代謝物時，不能采用與大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等相同的方法。所以本研究主要對阿維鏈霉菌代謝物樣品制備步驟進行了系統優化。

細胞清洗能夠去除培養基和胞外代謝物對胞內代謝物組的影響。由于胞外代謝物和培養基成分復雜，清洗不完整會嚴重影響胞內代謝物組的測定，而清洗過度會導致細胞壁受損嚴重，胞內代謝物大量滲漏，致使獲得的代謝物數目顯著減少。通過研究發現，細胞清洗3次能夠在不導致細胞破裂的情況下完全去除培養基和胞外物質。液氮反復凍融是提取胞內代謝物的主要方法，但對于具有較厚細胞壁的革蘭氏陽性細菌及真菌，反復凍融法通常不能充分提取其胞內代謝物。為了解決這一問題，本實驗室研究液氮研磨和珠磨法這兩種破碎細胞壁的方法發現，珠磨法比液氮研磨法能夠有效地破碎細胞壁。此外，研究還發現珠磨兩個循環可以充分提取胞內物質。代謝物組數據分析過程中，需要定性和定量盡可能多的物質來全面的描述代謝途徑、代謝調節及描述機制。由于代謝物在不同的提取溶劑中的提取效率不同，本研究比較了5種提取溶劑的提取效率，結果發現用甲醇∶氯仿∶水 = 2∶2∶1（V/V）的比例提取的胞內的代謝物質最全面，而且提取含量最高。通過對各樣品制備環節進行比較優化，最終得到了最適合阿維鏈霉菌代謝物分析樣品的制備方法。

圖6 阿維鏈霉菌胞內代謝物PCA分析得分圖（A）和載荷圖（B）

4 結論

利用本試驗室建立的阿維鏈霉菌代謝物組學樣品制備方法，對阿維菌素高產菌株（9-39）和野生菌株（WT）代謝物相對強度進行了分析，高產菌株的糖代謝和部分氨基酸代謝旺盛，這與蛋白組學研究的結果相吻合。因此本試驗室建立的代謝物提取分析方法適用于阿維鏈霉菌代謝物組研究。

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（責任編輯 狄艷紅）

Optimized Sample Preparation for Metabolome Studies on Streptomyces avermitilis by GC-MS

Guo Gang Tang Dan Tian Pingping Shi Xiufeng Cao Peng Gao Qiang
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology of Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin300457）

We established a method for preparing metabolome sample of Streptomyces avermitilis， including cell separation， washing，quenching， disruption and extraction conditions based on GC-MS analysis system， and applied it in the analysis of the metabolome of industrial strain 9-39 and wild type strain. The optimal conditions for sample preparation were as follows: separating cells by centrifugation， washing 3 times， quenching 5 minutes with liquid nitrogen， cell disruption with bead mill（3 cycles and 48 seconds per each cycle）， and extraction of metabolites（chloroform∶ethanol∶water = 2∶2∶1）. By using this optimized protocol， 59 differential compounds were identified and quantified， including amino acids， organic acids， fatty acids and saccharides. Our established method can be used to effectively analyze the Streptomyces avermitilis metabolites.

Streptomyces avermitilis；metabolomics；cell disruption；extraction；GC-MS

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.010

2014-09-24

國家“973”項目（2013CB734004），國家“863”項目（2012AA021302），國家自然科學基金項目（31370075，31471725）

郭剛，男，碩士研究生，研究方向：生物制藥；E-mail：guogangx@163.com

高強，男，教授，研究方向：代謝控制發酵；E-mail：gaoqiang@tust.edu.cn