凝膠色譜法測定頭孢菌素類藥物中高分子雜質的應用心得

祝飚　李蕾

【摘要】實際上，所謂的凝膠色譜法也是一種凝膠色譜技術，更是一種十分快捷、簡單的分離分析技術，其由于具備分離效果理想，操作方便等優點，因此受到了相關研究人員的喜愛，并在頭孢菌素類藥物中高分子雜質測定中得到了十分廣泛的應用，具有一定的推廣價值。因此，筆者通過結合自身多年實踐工作經驗，針對采用凝膠色譜法對頭孢菌素類藥物中高分子雜質的測定進行了詳細的論述，簡單介紹了相關操作流程，并得出以下相關結論，以供同行業人員參考交流。

【關鍵詞】凝膠色譜法 頭孢菌素類藥物 高分子雜質 測定

【中圖分類號】R927.2 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）02-0220-01

目前，根據大量臨床驗證研究表明，大部分由抗生素引起的過敏性反應普遍是與藥品中含有的高分子雜質有關聯。由此，我們可以判斷出，高分子雜質含量的多少將會對藥品安全性造成極大的影響，甚至還會對人們的身體健康構成威脅。因此，為了保障藥物質量，進一步提高藥品純度，防止不良時間的發生，我們必須通過采取相關有效的測定方法，有效檢測出頭孢菌素類藥物中高分子雜質的含量。對此，本文將重點對凝膠色譜法測定頭孢菌素類藥物中高分子雜質的應用心得進行了闡釋。

一儀器與實驗準備上的注意事項

通常情況下，在采用凝膠色譜法對頭孢菌素類藥物中高分子雜質含量進行測定時，必須要嚴格遵守實驗室中相關的檢定過程，全面掌握各種儀器設備的操作規范，從而確保測量結果的精確性。

1、儀器準備

在實驗的準備階段中，若是決定采用自行配置的簡單儀器設備，就要充分做好檢測單元、輸液單元以及數據記錄處理單元的三方面工作。其中，檢測環節是為了保證滿足于紫外檢測要求，而輸液單位則是為實驗順利開展所提供的可靠流速，同時通過對色譜工作站發出模擬信號，以便于后續數據的記錄處理。并且，在自行配置儀器系統使用過程中，一定要確保符合液相色譜儀的測定要求，制定出規范合理的檢測規程，定期進行檢定，以此來保證實驗結果的有效性。

2、凝膠色譜柱準備

在色譜柱規格的選擇上應該從儀器系統的最大進樣能力、所分析樣品的溶解能力以及檢測限度等方面綜合進行考慮。通常凝膠色譜柱的體積小于柱床體積，所以一般頭孢菌素抗生素高分子雜質測定的柱床體積應為60ml以上。

3、玻璃柱管的分端及凝膠介質的選取

在玻璃柱管的分端上，一般開口的玻璃柱管可以采用玻璃棉加開口橡膠塞來封端，也可以在一端燒結石英過濾板或者通過直接購買帶調節頭的商品玻璃柱管。凝膠色譜法在凝膠介質的選取上可選用的凝膠有很多種，目前對抗生素高分子雜質的測定多數采用的是葡聚糖凝膠，選取這種凝膠介質后一定要注意在使用之前需用水充分的溶脹，可以根據需要填制的凝膠柱柱床體積來具體計算用量。如果溶脹使采用蒸餾水浸泡的方式，也可以在溫度為4℃的冰箱中放置48小時，也可在水浴中煮沸一小時，這樣才能保證溶脹充分。在這兩種溶脹方式中都應該注意隨時攪拌出去氣泡，必要情況下還可以進一步的進行真空脫氣。

4、裝柱

將溶脹好的凝膠介質用蒸餾水懸浮靜置后，每次傾去上層液，以去除凝膠碎屑和雜質。按照這種方法進行多次洗滌，直到上層的精置液澄清為止。實踐中可將凝膠介質用水制成懸漿，然后一次性的倒人垂直放置的玻璃柱管中，待凝膠顆粒沉降完畢后即完成裝柱。也可在垂直放置的玻璃柱管和漏斗上放開柱管下口，保持液流順暢，用滴灌逐管從漏斗中加入凝膠懸漿，讓凝膠顆粒在蒸餾水中緩慢沉降，注意讓漏斗中隨時保持一定的凝膠懸漿。運用此種方法會使裝柱得時間較長，必要時可以在出柱口增加負壓加快裝柱時間。

二系統適用性實驗

系統適用性試驗對溶液的制備更加注重方便性和可操作性，系統適用性試驗用溶液的配制方法為用主成分對照品與雜質對照品混合配制，但還是會使得有些雜質對照品不能得到，如性質不穩定或分離提取技術要求太高等，但這些雜質峰恰恰又是與主成分峰最難分離的色譜峰。系統適用性試驗目前包括很多內容，主要考察對照品測定系統與高分子雜質測定系統中藍色葡聚糖2000溶液峰的保留時間的比值，以及理論板數和拖尾因子，以此來控制對照品測定與高分子雜質測定時儀器狀態的同一性。在以藍色葡聚糖2000的保留時間來表示高分子雜質的保留特征時，對照品色譜峰及高分子雜質色譜峰與藍色葡聚糖2000溶液色譜峰保留時間的比值都應控制在一定的限度內，由此才能實現對色譜柱狀態的正常控制。

三操作方法上的注意事項

1、樣品溶液及對照溶液的制備

具體操作中必須要按規定的標準來配制樣品溶液，由于某些高濃度抗生素溶液具有一定的不穩定性，所以通常對樣品溶液采取即溶即進的形式。對照溶液的制備上，要注意頭孢菌高分子雜質的含量測定，通常以樣品自身在SDS水溶液或純水中的締合物作為對照進行定量。在制備締合物時特別要注意對濃度及水的純度的控制，以此來保證締合完全。

2、進樣及進樣方式

一般我們在對頭孢菌素高分子雜質含量進行測定時，通常需要不同狀態的流動相，選擇出合適的對照溶液進行進樣。因此，只有事先將流動相更換之后，才能充分保證凝膠色譜柱的平衡性。并且，筆者建議盡量采用凝膠色譜儀自動進樣方式，或是在特殊情況下，選擇手動進樣。然而，無論是任何一種進樣方式，在實驗中，都必須保證色譜柱端無縫隙處，從而避免樣品擴散，影響分離效果。另外，在對頭孢菌素高分子進行自動取樣的過程中，也要切實遵守相關的液相色譜操作規程。

3、凝膠面的平整

如果選擇了手動進樣方式，就一定要保證凝膠表面的平整性和完整性。并在進樣之前，事先使用滴管吸取掉凝膠表面積壓的液體，確保色譜柱下端能夠順利流通，直到色譜柱內的溶液流降到凝表面時，我們才可以應用相應的定量器具，對樣品溶液進行精密的量取。之后，我們還需要將樣品溶液滴加到色譜柱的凝膠表面中，同時還要對色譜柱管內壁上殘留的樣品溶液進行清洗。最后，也是最重要的一個實驗環節，相關實驗人員要在色譜柱頂端緩慢注入適量的流動相，認真做好進樣時間的記錄工作。

4、記錄對照及結果

要分別記錄樣品和對照溶液的色譜圖，積分對照溶液的峰面積和樣品溶液中處于外水體積的高聚物雜質面積，按外標法以峰面積計算樣品中高分子雜質的含量。按平行實驗的平均值作為樣品中高分子雜質含量的最終結果，并與標準規定限度比較后作出是否符合規定的判斷。

5、樣量分析

在一般高效液相色譜儀上使用凝膠柱，應嚴格限制泵壓。由于一般高壓液相色譜管路和檢測器通路狹窄，極易發生堵塞，所以要注意盡量減少將出柱液連接到檢測器的時間，尤其是新填充的色譜柱更應經水或流動相充分平衡后再連接到檢測器。

四結束語

通過實驗結果表明，大部分抗生素藥物中的高分子雜質已經超出了藥物本身的雜質，嚴重影響了藥物質量，殘留了部分污染物質，再加之抗生素在貯存過程中，其分子很容易發生聚合反應，最終產生大量的聚合物雜質，大大降低了藥品的純度。因此，采用高效的凝膠色譜法對頭孢菌素中的高分子雜質含量的測量是非常至關重要的，操作人員必須嚴格遵守相應的檢測要求，加強對凝膠色譜法的合理運用及改進，進一步提高頭孢菌素類型藥物的質量和純度，從而達到理想的治療效果。

參考文獻

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