高效液相色譜法測定葉酸片的含量

柳麗新

【摘 要】葉酸是由喋呤啶、對氨基苯甲酸和谷氨酸等組成的化合物，是一種水溶性B族維生素，相當于蝶酰谷氨酸。固定相為：依利特hypersil BDSC18 色譜柱（4.6*250*5u ），乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1）為流動相，檢測波長為254nm；葉酸在20～280μg·mL-1范圍內呈良好的線性關系。葉酸的平均回收率為99.3%。本法簡便、重現性好、回收率高，可用于葉酸片中葉酸的含量測定。

【關鍵詞】葉酸片；葉酸；測定

葉酸是由喋呤啶、對氨基苯甲酸和谷氨酸等組成的化合物，是一種水溶性B族維生素，相當于蝶酰谷氨酸[1-2]。葉酸從菠菜葉中提取純化的，故而命名為葉酸。葉酸對孕婦尤其重要。葉酸用于預防胎兒神經管畸形，準媽媽在備孕期間就服用0.4毫克葉酸可以下降胎兒神經管畸形率85%[3-4]。如在懷孕頭3個月內缺乏葉酸，可導致胎兒神經管發育缺陷，從而增加裂腦兒，無腦兒的發生率。人類如缺乏葉酸可引起巨紅細胞性貧血以及白細胞減少癥，還會導致身體無力、易怒、沒胃口以及精神病癥狀[5-7]。本文用高效液相法對葉酸片中的葉酸的進行了含量測定。

1.儀器與試藥

1.1儀器

LC-100（梯度配置）高效液相色譜儀（上海伍豐科學儀器有限公司） ；CO-1000型色譜柱溫箱（武漢恒信世紀科技有限公司）；制冷和加熱循環槽（上海汗諾儀器有限公司）；UV-1800紫外/可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；ELGA超純水器（上海瀾銳儀器科技有限公司）；ABS 220-4分析天平（德祥科技有限公司）；3升基本型超聲波清洗器（天津市瑞普電子儀器公司）；TΜ-1901 雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.2試藥

乙腈（杭州興成化工有限公司）、磷酸（江西省新干縣金成化工廠）、鹽酸（襄樊金譯成精細化工有限公司）、磷酸氫二銨（淄博市淄川區鑫川化工廠）、冰醋酸（吳江市龍申化工有限公司）、甲醇（江西省新干縣金成化工廠）、冰乙酸（杭州興成化工有限公司）、四氫呋喃（吳江市龍申化工有限公司）。

2.含量測定

2.1色譜條件

依據查閱文獻及考查的結果，確定色譜條件如下[8-12]。色譜柱為依利特hypersil BDSC18色譜柱（4.6*250*5u ）；乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1）為流動相；檢測波長為254nm；流速1.0mL·min-1；柱溫：30℃。理論板數按葉酸峰計算應不得低于2000。

2.2供試品溶液的制備

取葉酸片適量，研細，精密稱定至容量瓶內，加適量5%氨水超聲溶解，放涼，用水定容，過0.45μm的濾膜，即得。

2.3對照品溶液的制備

精密稱取葉酸對照品約50mg，置50毫升棕色容量瓶中，用5%氨水超聲波振蕩溶解并用水稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10毫升，置100毫升棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1mL溶液中含葉酸100μg）。

2.4陰性干擾試驗

按方中比例取葉酸片輔料，按照制備工藝方法制成陰性制劑，按2.3項下方法制成供試品溶液，按色譜條件測定。結果表明：在選定條件下測得的陰性液吸收曲線在與葉酸相同保留時間處不存在吸收峰，說明此方法具有較強的專屬性。

2.5標準曲線的制備

制備濃度為20μg·mL-1、40μg·mL-1、80μg·mL-1、160μg·mL-1、200μg·mL-1、240μg·mL-1、280μg·mL-1的對照品溶液，分別精密吸取10μL注入HPLC，記錄色譜圖。以峰面積積分值A（μg）為橫坐標，進樣量為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。試驗表明，葉酸對照品在40～320μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.6精密度試驗

精密吸取葉酸對照品溶液10μL重復進樣6次，測定峰面積積分值，對照品峰面積積分值的RSD為0.77%。結果表明，本實驗精密度良好。

2.7重現性試驗

分別稱取同批葉酸片樣品6份，分別制備成供試品，按色譜條件測定含量，并計算樣品的RSD值為0.65%，結果表明，此含量測定方法的重現性良好。

2.8穩定性試驗

取供試品溶液，分別在0，1，2，3，4h精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，進樣測定，供試品葉酸峰面積積分值的RSD為0.89%。結果表明葉酸至少在4h內穩定。

2.9回收率試驗

采用加樣回收試驗，取已知含量的同一批供試品各6份，精密稱定，分精密添加一定量的葉酸對照品，按供試品制備所述方法制備供試品溶液，測定含量（同時測定樣品含量），計算回收率。6次測定的平均回收率為99.3%，RSD為0.95%。

2.10樣品含量測定

依照上述含量測定方法，測定葉酸片三批樣品中葉酸的含量，結果三批樣品的含量分別為標示量的99.3%、99.6%、100.1%。

3.討論

葉酸溶于熱的稀鹽酸和硫磺，略溶于氫氧化堿和碳酸堿溶液，微溶于甲醇，不溶于乙醇和丁醇。本實驗采用5%氨水溶解效果較好。分別考察乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1），0.05mol.L-1磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調pH到3.0）-乙腈（20∶80），乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：20：55∶0.1），乙腈-甲醇-冰乙酸-水（15：15∶3∶67），乙腈-甲醇-四氫呋喃-水（10：15：35∶40），乙腈-甲醇-水（20∶20：60），磷酸二氫鉀6.8g與0.1mol·L-1氫氧化鉀溶液70mL，加水稀釋至800mL，調節pH至6.3，加甲醇200mL，用水稀釋成1000mL，磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L磷酸氫二銨溶液， 用磷酸調節pH 值6.0）-乙腈（60：40）不同比例的流動相，結果以乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1）為流動相，供試品各峰分離效果最好，故選用乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1）為流動相。本實驗方法是一種簡便、準確、安全的測定葉酸片含量的方法。葉酸片中葉酸的含量為標示量的95-105%。 [科]

【參考文獻】

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