P16蛋白在正常宮頸、CIN、宮頸癌組織中的表達(dá)差異及意義

鐘偉珍 唐忠慶 嚴(yán)敏莉

【摘? 要】目的：探討P16蛋白在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervicalintraepithelialneoplasias，CIN）、宮頸癌組織中的表達(dá)差異及意義。方法：收集本院2012年10月～2013年10月行除的宮頸癌（3例）、CINⅡ、Ⅲ（61例）組織的石蠟標(biāo)本64例進(jìn)行研究，并收集30例正常宮頸組織標(biāo)本作為對(duì)照組。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行檢測，得出其中的P16蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：在CIN組織和宮頸癌組織中，較之正常的宮頸組織，p16蛋白的陽性表達(dá)率顯著增加。而將宮頸癌組織與正常宮頸組織，以及正常宮頸組織和CIN組織，還有CIN組織與宮頸癌組織進(jìn)行兩兩對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)不同組織的p16蛋白陽性表達(dá)率經(jīng)比較均存在顯著差異。結(jié)論：16蛋白在正常宮頸、CIN以及宮頸癌組織中的表達(dá)存在較大的差異，臨床可以將16蛋白作為宮頸癌篩查的重要指標(biāo)之一。

【關(guān)鍵詞】宮頸;宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervicalintraepithelialneoplasias，CIN）;宮頸癌;P16蛋白;表達(dá)

宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervicalintraepithelialneoplasias，CIN）是一組與宮頸癌關(guān)系較為密切的病變，研究發(fā)現(xiàn)，P16蛋白是一種抗癌基因，廣泛存在于人體的宮頸細(xì)胞之中，與宮頸上皮內(nèi)瘤變等關(guān)系密切^[1]。一旦，P16蛋白發(fā)生變異，便會(huì)逐漸轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞。因此，臨床積極對(duì)p16蛋白正常宮頸和CIN以及宮頸癌組織中的表達(dá)水平進(jìn)行研究，可以幫助人們更好的了解疾病的發(fā)生與發(fā)展等，提高臨床治療的準(zhǔn)確性，具有較強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義^[2]。本研究中，筆者收集本院2012年10月～2013年10月行除的宮頸癌（3例）、CINⅡ、Ⅲ（一共61例）組織的石蠟標(biāo)本64例進(jìn)行研究，并收集30例正常宮頸組織標(biāo)本作為對(duì)照組，探討P16蛋白在正常宮頸、CIN、宮頸癌組織中的表達(dá)差異及意義?，F(xiàn)將研究結(jié)果進(jìn)行如下報(bào)告。

1一般資料和方法

1.1一般資料

收集本院2012年10月～2013年10月行除的宮頸癌（3例）、CINⅡ、Ⅲ（61例）組織的石蠟標(biāo)本64例進(jìn)行研究，患者年齡23 ～ 59歲。另外，從同期在本院接受健康體檢的健康人群中收集30例正常宮頸組織標(biāo)本作為對(duì)照組。研究獲得醫(yī)學(xué)倫理學(xué)相關(guān)部門同意，所有患者均了解研究相關(guān)情況，并簽署知情同意書，自愿參與研究。

1.2方法

利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行檢測，分析其P16蛋白表達(dá)情況。

1.2.1試劑

（1）p16鼠抗人單克隆抗體購自上海天呈醫(yī)流科技股份有限公司;（2）超敏SP（鼠/兔）試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;（3）AB酶底物顯色劑購自上海領(lǐng)潮生物科技有限公司;（4）PH 6.0枸櫞酸緩沖液（自配）（5）0.01MPH7.4 PBS緩沖液（自配）。

1.2.2儀器和設(shè)備

（1）醫(yī)用凈化工作臺(tái)購自北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;（2）單道可調(diào)式微量移液器購自上海艾研生物科技有限公司;（3）雙目光學(xué)顯微鏡購自上海明茲儀器有限公司;（4）推拿式切片機(jī)購自香港萬浩科技有限公司;（5）隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海璽恒實(shí)業(yè)有限公司;（6）生物組織攤烤片機(jī)購自湖北康益達(dá)醫(yī)療科技有限公司;

1.2.3檢測方法

將購買試劑時(shí)提供的p16陽性切片作為陽性對(duì)照，將購買磷酸鹽緩沖液PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。利用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶連接（S-P法）檢測不同組織中的p16表達(dá)情況。

1.3檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

p16蛋白的蛋白產(chǎn)物位于細(xì)胞核或者細(xì)胞漿，如果為陽性，則呈黃色或棕黃色。計(jì)數(shù)：利用100倍顯微鏡，觀察每張切片 10個(gè)以上的獨(dú)立視野，選取其中陽性細(xì)胞數(shù)最多的5個(gè)視野，繼續(xù)利用400倍視野予以記數(shù)，將5個(gè)視野平均值作為最終結(jié)果。根據(jù)陽性細(xì)胞比例和分布情況進(jìn)行判定：（1）陰性（-）：單個(gè)細(xì)胞染色，陽性細(xì)胞數(shù)小于5%，（2）弱陽性：（+）小的或散在細(xì)胞團(tuán)染色，陽性細(xì)胞數(shù)5%～24%;（3）中度陽性（++）：簇狀或者片狀細(xì)胞染色，陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%;（4）強(qiáng)陽性（+++）：彌散細(xì)胞染色，陽性細(xì)胞數(shù)在50%以上。（5）過表達(dá)。（++-+++）。本研究中，弱陽性表達(dá)以下均計(jì)為陰性，過表達(dá)視為陽性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

研究所得數(shù)據(jù)均輸入Excel表格，并使用SPSS 公司推出的SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，研究所得計(jì)數(shù)資料均進(jìn)行Χ²檢驗(yàn)，計(jì)量資料均進(jìn)行t檢驗(yàn)。并以P<0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2結(jié)果

經(jīng)統(tǒng)計(jì)和檢測，p16蛋白在不同宮頸組織中的表達(dá)情況存在顯著差異，（P<0.05）。其中，在CIN組織和宮頸癌組織中，較之正常的宮頸組織，p16蛋白的陽性表達(dá)率顯著增加。而將宮頸癌組織與正常宮頸組織，以及正常宮頸組織和CIN組織，還有CIN組織與宮頸癌組織進(jìn)行兩兩對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)不同組織的p16蛋白陽性表達(dá)率經(jīng)比較均存在顯著差異。具體結(jié)果如表1所示：

表1? p16蛋白在宮頸組織中的表達(dá)情況分析

組織分類

例

p16蛋白

陰性（例）陽性（例）

陽性表達(dá)率（%）

P

正常組織

CIN

宮頸癌

30

61

3

30

43

1

0

18

2

0

29.5

66.7

/

<0.05

<0.05

3討論

當(dāng)人體內(nèi)出現(xiàn)失控性細(xì)胞增殖現(xiàn)象的時(shí)候，便會(huì)導(dǎo)致各種腫瘤的出現(xiàn)。腫瘤的出現(xiàn)受累于多重遺傳和表觀遺傳水平上的異常，在對(duì)各種腫瘤進(jìn)行診治的時(shí)候，存在較大的難度^[3]。分析原因，是因?yàn)槟[瘤的其基因組和表觀基因組在不同生物層面上具有極度的異質(zhì)性，在水平上具有極強(qiáng)的可變性^[4]。另外，腫瘤還對(duì)各種環(huán)境都具有極強(qiáng)的適應(yīng)性。因此，在對(duì)各種類型的腫瘤進(jìn)行診斷和治療的過程中，便需要積極的利用各種新型的測序技術(shù)，利用各種高效的影像學(xué)手段，并尋找新型的分子標(biāo)志物，以更好的掌握腫瘤發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)問題，更好的指導(dǎo)臨床治療等。

3.1宮頸病變

宮頸癌是一種常見的惡性腫瘤，對(duì)女性的危害極大。經(jīng)過大量的研究發(fā)現(xiàn)，宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervicalintraepithelialneoplasias，CIN）是一組與宮頸癌關(guān)系較為密切的病變。但是，從宮頸病變發(fā)展為宮頸癌需要較長的時(shí)間，過程較為緩慢^[5]。而且，很多患者在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程并沒有表現(xiàn)出特異性的征兆，因此較易出現(xiàn)病情的延誤，錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)。隨著臨床醫(yī)學(xué)研究水平的不斷提高，人們開始對(duì) 宮頸癌的發(fā)生發(fā)展和不同控制細(xì)胞的生長、分化的關(guān)系等進(jìn)行研究，并分析腫瘤的發(fā)展是否與細(xì)胞基因受損之間存在一定的內(nèi)在聯(lián)系。經(jīng)過大量的研究人們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)不同控制細(xì)胞受到一定的損傷之后，便會(huì)激活機(jī)體內(nèi)的癌基因，并導(dǎo)致各種抑癌基因的丟失或失活，從而引發(fā)腫瘤的出現(xiàn)。

3.2 p16蛋白

近年來，隨著現(xiàn)代細(xì)胞分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，利用新的生物工程學(xué)技術(shù)，如克隆與序列分析、DNA重組、分子雜交、單抗和ELISA技術(shù)、PCR、限制性長度多態(tài)性分析和基因轉(zhuǎn)染等對(duì)宮頸癌的癌變過程進(jìn)行了大量的研究工作。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌的發(fā)展過程中，抗癌基因有p53、p16等，以點(diǎn)突變和缺失為主^[6]。這些異常基因在癌變過程的不同時(shí)期影響細(xì)胞異型增生，癌細(xì)胞的分化程度、浸潤和轉(zhuǎn)移。p16基因的缺失或表達(dá)水平低下以及p53點(diǎn)突變或缺失者癌細(xì)胞分化程度低，浸潤和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，故與惡性表型相關(guān)。在卵巢癌、子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌等婦科惡性腫瘤中，均存在p16基因的表達(dá)異常^[7]。p16蛋白是一種細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控蛋白，又被稱為p16/CDKN2基因或者多種瘤抑制因子I（MTS-1）。p16蛋白可以指令細(xì)胞停止分裂，發(fā)揮出較強(qiáng)的抵御癌癥的作用，有效阻擊癌細(xì)胞，使之停止分裂^[8]。p16蛋白可以有效抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，因此對(duì)細(xì)胞的整個(gè)周期過程發(fā)揮出較強(qiáng)的“減速”作用。在具體的作用過程中，p16可以積極的與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）產(chǎn)生特異性的結(jié)合，導(dǎo)致其失活^[9]。于是進(jìn)一步發(fā)揮出對(duì)細(xì)胞周期的反向調(diào)節(jié)效應(yīng)，達(dá)到“減速”的目的。一旦p16蛋白受到各種因素的影響，出現(xiàn)較強(qiáng)的變異現(xiàn)象，便會(huì)對(duì)細(xì)胞的增殖周期產(chǎn)生較大的影響，導(dǎo)致其出現(xiàn)失控，于是細(xì)胞便會(huì)呈現(xiàn)出無限生長的情況^[10]。

3.3 p16蛋白與宮頸疾病

大量的研究發(fā)現(xiàn)，在各種婦科惡性腫瘤例如宮頸癌中，存在較為明顯的p16蛋白異常表達(dá)的情況^[11，12]。p16蛋白的異常變化包括了多種類型，例如p16蛋白啟動(dòng)子甲基化和染色體異位以及體細(xì)胞突變和基因缺失。不同的因素影響下，均會(huì)導(dǎo)致 p16蛋白的異常表達(dá)。例如，如果出現(xiàn)p16蛋白啟動(dòng)子甲基化，則會(huì)導(dǎo)致基因出現(xiàn)沉默繼而基失活，引發(fā)宮頸癌。研究發(fā)現(xiàn)，在不同病變性質(zhì)的宮頸組織中，p16 蛋白的表達(dá)均會(huì)出現(xiàn)不同表達(dá)情況^[13]。還有學(xué)者經(jīng)過研究報(bào)道，p16蛋白的陽性表達(dá)情況和宮頸癌的臨床分期之間呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)關(guān)系。其中，宮頸癌Ⅲ期和Ⅳ期病理患者的p16蛋白的陽性表達(dá)程度顯著低于宮頸癌Ⅰ期、Ⅱ期病理患者^[16]。汪勤^[14]等通過利用免疫組化SP法檢測正常子宮頸或炎性病變組織、CIN1～3中的p16蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，p16 蛋白表達(dá)和子宮頸上皮內(nèi)瘤變的病變進(jìn)展之間存在十分密切的聯(lián)系，因此，通過對(duì)檢測p16蛋白的表達(dá)水平，可以更好的對(duì) 臨床CIN進(jìn)行分級(jí)診斷，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。經(jīng)過大量的研究，學(xué)者們普遍認(rèn)為p16蛋白的實(shí)際表達(dá)情況和宮頸疾病之間存在較為密切的聯(lián)系^{[15，16]}。本研究最終結(jié)果顯示，在CIN組織和宮頸癌組織中，較之正常的宮頸組織，p16蛋白的陽性表達(dá)率顯著增加。而將宮頸癌組織與正常宮頸組織，以及正常宮頸組織和CIN組織，還有CIN組織與宮頸癌組織進(jìn)行兩兩對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)不同組織的p16蛋白陽性表達(dá)率經(jīng)比較均存在顯著差異。即提示，在正常宮頸、CIN以及宮頸癌組織中，p16蛋白的表達(dá)存在較為明顯的差異。與其他一些學(xué)者的研究結(jié)果進(jìn)行比較，基本一致。

另外，徐東曉等^[17]經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，在增生期子宮內(nèi)膜、單純型增生過長、復(fù)雜型增生過長、非典型增生過長和子宮內(nèi)膜癌中，p16蛋白的表達(dá)情況呈現(xiàn)出依次下降的情況。其中，在p16蛋白的實(shí)際表達(dá)方面，增生期子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜癌之間存在顯著差異（P<0.05）。研究還發(fā)現(xiàn)，p16蛋白在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不同情況以及不同組織學(xué)分級(jí)的組別之中也存在較大的差異，（均P<0.05）。最終，研究學(xué)者提出觀點(diǎn)，認(rèn)為p16蛋白 的表達(dá)和子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展之間存在一定的關(guān)系，并可以積極的應(yīng)用對(duì)子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后之中。但是，受到本研究樣本容量和觀察時(shí)間的影響，對(duì)于 p16 和宮頸癌預(yù)后之間的關(guān)系以及臨床應(yīng)用價(jià)值等，并沒有予以進(jìn)一步的研究。因此，本研究還存在一定不足之處。進(jìn)一步的結(jié)果，還需要在今后的研究中不斷擴(kuò)大樣本容量，延長研究時(shí)間，增加觀察指標(biāo)等，予以進(jìn)一步的分析探討。

綜上所述，p16蛋白在正常宮頸、CIN以及宮頸癌組織中的表達(dá)呈現(xiàn)出較大的差異。其中，p16蛋白的陽性表達(dá)發(fā)生在宮頸癌和癌前病變整個(gè)階段。因此，對(duì)p16蛋白陽性表達(dá)的檢測，可以積極的應(yīng)用于臨床對(duì)宮頸癌的篩查和診斷之中。所以，在今后的林從檢測過程中，可以積極的將p16蛋白作為一種特殊的腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行檢測，以更好的提高診斷效果，指導(dǎo)臨床治療。

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