對蝦白斑病毒1197基因的表達和產物純化的研究

陳舒貞?張思萍

摘 要：目的 對對蝦白斑病毒1197基因的表達和產物純化進行研究。方法 對對蝦白斑病毒的早晚期基因1197基因的表達和產物純化進行研究，構建PGEX—3Xll97表達質粒，以及在大腸桿菌DE3中表達PGEX—3Xll97，對表達物進行純化。使用FPLC的方法對融合蛋白進行純化，并對表達產物進行復性處理。結果 將對蝦白斑病毒1197基因與PGEX—3X載體進行連接，并鑒定PCR和酶切。在大腸桿菌DE3中，PGEX—3Xll97得到了表達和產物純化的融合蛋白。結論 本研究對對蝦白斑病毒1197基因的表達和產物進行了純化，得到了1197基因表達的融合蛋白。

關鍵詞：產物純化;對蝦白斑病毒;1197基因

上個世紀末以來，我國養(yǎng)殖對蝦的死亡現象就時有發(fā)生，給對蝦養(yǎng)殖戶帶來了巨大的損失。在研究中發(fā)現，能夠在體外對對蝦白斑病毒的早晚期基因1197進行切割。本文主要是對1197基因進行原核表達，并對其表達的產物進行純化，從而進一步的研究1197基因表達產物的功能。

一、材料與方法

1. 材料

使用本實驗室的對蝦白斑病毒1197基因，在E61質粒中進行構建。使用TaKaRa公司生產的BamHI和EcoRI內切酶，Phaonacia公司生產的PGEX—3X，本組保存的菌株E.coliDE3、E.eoliDH5a、以及其他的分析純試劑。

2.方法

（1）構建PGEX—3Xll97表達質粒

使用E61質粒作為模板，以1197基因讀框3及5端順序為依據，將下游引物和上游引物合成，并將其在50μLPCR反應混合液中對其進行94℃5min的變性，并對其進行30循環(huán)擴增。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對產物進行鑒定。用BamHI和EcoRI雙酶切PGEX—3X，并使用低熔點膠回收法來對產物進行轉化、常規(guī)連接和純化。經過轉化得到了含有DE3鈣細胞的菌株，并對其含有1197基因的重組表達質粒進行鑒定。

（2）在大腸桿菌DE3中表達PGEX—3X1197

將含有PGEX—3X1197質粒的大腸桿菌DE3單菌落培養(yǎng)出來，將其加入300mL的LB培養(yǎng)瓶，比例為1：100。

（3）純化表達產物

對純化融合蛋白使用谷胱甘肽親和層析柱分離，并收集樣品。對融合蛋白使用FPLC的方法進行純化。對包涵體進行處理，使用300mL的菌液進行破菌，并進行10分鐘的離心，在3mL裂解緩沖液中進行沉淀懸浮。

對純化融合蛋白使用FPLC進行分離，并適當濃縮包涵體樣品，使用A緩沖液進行透析，用微孔濾膜過濾樣品，并進行2mL的上樣。設計合適的NaCI濃度梯度，并對離子交換柱進行洗脫，對樣品進行收集。

（4）對表達產物的進行復性處理

主要是在27mL溶解緩沖液溶液中緩慢的加入經過處理的包涵體，依次透析PBS、2mol/L尿素、4mol/L尿素、6mol/L尿素。離心所得到的樣品，然后使用谷胱甘肽S—轉移酶親和層對上清液進行分離純化。

二、結果

1.鑒定與構建表達質粒PGEX—3X1197

以已知的對蝦白斑病毒1197的基因序列3端及5端為基礎，將下游引物P2和上游引物P1合成出來，在對其進行擴增，將對蝦白斑病毒1197基因得出來，并將其與載體PGEX—3X進行連接，進行PCR鑒定和酶切鑒定。

2. 純化大腸桿菌DE3中PGEX—3X1197的產物

可以將PGEX—3X的表達質粒進行編碼，然后將含有外源讀框的DNA片段插入，將連接外源基因產物的融合蛋白表達出來，并使用GST親和柱進行純化。然而由于包涵體包涵了該基因的產物，難以進行純化。

用8M尿素處理包涵體，在融合蛋白在透析后的上清中含量較高，進而對其進行進一步的透析，仍然沒有得到純化的融合蛋白。對包涵體進行處理，并用FPLC陰離子交換層析法對上清樣品進行分析，得到了4個小峰。根據對小峰的鑒定，得到了融合蛋白。

三、討論

從上世紀末開始，我國出現了對蝦白斑病毒，主要癥狀是蝦體的頭胸甲部位出現白斑，給我國的沿海對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。當前的研究表明，在5‘端非編碼區(qū)，1197基因具有AAGGTT早期基因啟動子元件、GTGT結構域、TATA box。因此本文認為這是一個病毒蛋白的調控因子，其能夠參與病毒復制。在本次研究中，載體使用了pGEx—3x表達，并對構建表達質粒進行克隆，對大腸桿菌中的pGEX3X—1197進行表達和誘導。

經過研究發(fā)現，在大腸桿菌的包含體重，該基因產物語其他基因產物有所不同，盡管裂解包含體之后能夠獲得較高表達量的產物，但是卻具有較大的純化難度。要使用去垢劑來裂解包含體、分離蛋白質，例如鹽酸胍和尿素、SDS等。這也導致了表達產物的變性率較高，難以進行純化分離。

本次試驗使用的方法是蛋白質復性方法，在尿素中進行從高濃度到低濃度的透析，但是效果仍然不理想。這是由于GST的親和層析柱難以進行結合。最后，本實驗使用了透析包涵體、鹽酸胍和尿素處理，并在離析中使用了FPLC陰離子，從而實現了對該基因表達的融合蛋白的成功純化，此時NaCI梯度濃度為30%。至于該蛋白質的功能是否會受到尿素引起的變性作用的影響，還需要進行進一步的考證。

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