改良小鼠腎移植模型的建立

黃健兵, 丁芳寶, 劉　浩, 梅　舉

（上海交通大學醫學院附屬新華醫院心胸外科, 上海　200092）

改良小鼠腎移植模型的建立

黃健兵, 丁芳寶, 劉浩, 梅舉

（上海交通大學醫學院附屬新華醫院心胸外科, 上海200092）

目的改進小鼠腹腔腎臟移植的手術方法，提高手術成功率。方法選用25對C57BL/6小鼠行同種同品系腎臟移植手術，8只C57BL/6小鼠切除腎臟作對照。簡化供體腎獲取方法，從供體腎背側開始分離，并減少腎動靜脈游離范圍，腎動脈開口以血管片方式獲取。改進動靜脈吻合技術，將供體腎動、靜脈分別與受體腹主動脈、下腔靜脈行端側吻合。尿道重建將供體腎輸尿管末端引入膀胱內，固定輸尿管壁于膀胱外膜。分兩期切除受體自身腎臟。結果手術成功率為92%，總手術時間為47.6±8.7 min，熱缺血時間3～5 s，冷缺血時間31.1±6.3 min。結論小鼠腹腔異位腎臟移植手術方法的改進能提高手術成功率，易于學習掌握，值得推廣應用。

小鼠； 腎； 移植； 動物模型

自1973年Skoskiewicz等［1］首次開展小鼠腎臟移植手術以來，全球有多家較大的移植中心進行了此手術，最初主要用于不同基因小鼠腎臟移植后免疫排斥的研究，但由于該手術難度較大，早期手術成功率不高（僅33%～50%）［2］，且使用小鼠皮膚及心臟移植已可很好地進行免疫排斥研究，小鼠腎移植在1980年代后未能廣泛開展。但隨著轉基因技術的發展，轉基因動物器官移植模型將成為從分子水平研究移植免疫的新手段。而相對于大鼠及其它大動物而言，小鼠有其不可替代的優點： 人們對小鼠基因組特征的認識比大鼠及其它任何大動物都清楚，轉基因小鼠種系較純, 已有大量的純種小鼠及單抗可用，而有些蛋白成分如酶或趨化因子只能通過特定細菌或細胞分泌產生，產量非常少，無法批量用于大動物甚至大鼠。另外，小鼠腎臟移植與其他器官移植相比，其移植物在主要組織相容性抗原有一定差異的情況下, 仍可能長期存活, 更適于研究排斥反應長期發展過程中的免疫調控機制。因此小鼠腎移植模型再次成為研究的熱點。 作者在借鑒國內外報道的手術技術的基礎上，通過不斷的摸索及大量的練習，改進了小鼠腎移植模型，使其更加簡便易行，成功率較高。

1　材料與方法

1.1動物及分組

清潔級雌性C57BL/6 （H2b） 小鼠58 只, 體質量16～22 g, 購自上海交通大學醫學院實驗動物科學部［SYXK（滬） 2013-0050］, 并飼養（飼喂全價營養顆粒飼料）在上海交通大學醫學院附屬新華醫院動物實驗室［SYXK（滬）2013-0106］, 6～8 周齡時手術。50只小鼠隨機分25對作腎臟移植，8只小鼠作對照。

1.2手術器械及試劑

手術顯微鏡（上海醫用光學儀器廠）； 血管夾（Accurate Surgical & Scientific Instruments 公司） ；顯微持針器（Eriem Surgical 公司）； 顯微剪刀和鑷子（Fine Science Tools 公司）； 11/0 帶針縫線和6/0 醫用絲線（上海金環醫用縫線廠） ； 戊巴比妥鈉（Sigma公司，P3761）、異氟烷（河北九派制藥股份有限公司，H19980141）和肝素鈉（上海醫藥集團公司）。手術操作均在10～25倍顯微鏡下完成。

1.3手術方法

1.3.1供體手術采用腹腔注射質量分數0. 65% 戊巴比妥鈉（0.01 mL/g） 麻醉。剃除腹部被毛，小鼠取仰臥位，術野消毒。取腹正中切口，自制拉鉤

1.3.2受體手術與供體手術相同方法麻醉小鼠后剃毛，取仰臥位固定，尾端朝向術者。術野消毒，腹部正中切口自制拉鉤牽引固定； 將小腸向左上方推移至腹腔外，并以濕潤的小紗布覆蓋保護；游離顯露出約5 mm長的一段腹主動脈和下腔靜脈，以血管夾將動靜脈一并鉗夾固定（圖2）。縱行剪開腹主動脈和下腔靜脈。首先行動脈端側吻合，供腎置于左側，動、靜脈吻合順序見圖3； 吻合完成后，開放血管夾，可見腎臟血供恢復，呈紅色。輸尿管重建方法： 用顯微血管鑷從膀胱前下方無血管區刺入，自后上方無血管區刺出，夾住供體輸尿管末端，將輸尿管拉入膀胱并從下方拉出約3 mm，用顯微血管夾夾住供體輸尿管末端，在供體輸尿管穿入膀胱的地方利用供體輸尿管的脂肪等結締組織與膀胱壁間斷縫合3針固定，剪去被夾輸尿管末端，使其新末端自然收縮入膀胱內, 最后荷包縫合該處膀胱開口。輕提輸尿管，確認固定良好，膀胱充盈后輸尿管口周圍無滲漏。

游離受體左腎腎蒂組織，套8-0絲線結扎，于結扎線遠心端切除受體左腎，保留少量腎組織可防止結扎線滑脫。腸管復位，全層連續縫合關閉腹部切口。移植后3 d以異氟烷 吸入麻醉后，經右肋下切口顯露右腎，套8-0絲線結扎腎蒂后切除右腎。全層連續縫合關閉肋下切口。

1.3.3對照組手術與供體手術相同方法麻醉小鼠后剃毛，取仰臥位固定，術野消毒，腹部正中切口自制拉鉤牽引固定，游離左腎腎蒂，套8-0絲線結扎，于結扎線遠心端切除左腎。全層連續縫合關閉腹部切口。3 d后以異氟烷 吸入麻醉，經右肋下切口切除右腎。

1.4術后處理

術后將小鼠置于37 ℃暖箱內復溫, 自由活動后放回籠內, 正常進食水。每日觀察小鼠活動情況。

圖1　取腎動脈開口血管片示意圖

圖2　血管夾示意圖

A： 動脈吻合順序，腎臟放于左側，先將供體動脈口血管片上端與受體動脈切口上端a點間斷縫一針，再將供體血管片下端與切口下端b點縫合一針，以b點處縫線沿右側向上連續縫合，至上端后將供體腎翻轉至右側，繼續連續縫合左側緣至下端b點處與線頭打結，完成動脈吻合。B： 靜脈吻合順序，供體靜脈口下端與受體靜脈切口下端c點間斷縫合一針固定，上端d點縫合一針后以此針為連續縫合線，先于右側緣進針后于血管內向下連續縫合右側緣，至下端后穿至血管外，再沿左側緣向上連續縫合，至d點與線頭打結完成靜脈吻合

2　結果

供體手術時間為8.8±2.5 min , 熱缺血時間約3～5 s, 冷缺血時間31.1±6.3 min, 動、靜脈吻合時間24.7±5.6 min, 輸尿管吻合時間4.5±1.0 min，總手術時間為47.6±8.7 min。對照組所有小鼠均在二期腎切除后3 d內死亡。考慮到移植腎在術后一周內有慢性血栓形成的可能，移植組均以二期腎切除后觀察10 d為限, 能正常存活且活動良好視為手術成功，移植組的手術成功率為92%（表1）。共死亡2例, 其1例在術后即刻出現腎動脈吻合口血栓, 1例術后1周內死亡，探查提示腎動脈血栓。

3　討論

隨著轉基因技術的發展，小鼠的腎臟移植模型日趨受到重視，但因其技術要求較高，尚未廣泛開展。目前開展小鼠腎移植的中心遠較其他移植手術少，成功率多在50%～90%［1,3-8］, 總手術時間可控制在70～80 min［4］, 本實驗改進手術方法后, 成功率達到了92%, 總手術時間減少至47.6±8.7 min,體現了一定的優勢。

表 1　腎移植組及對照組小鼠存活時間

本手術技術在參考前人經驗［9］的基礎上作了新的改進，并通過大量練習后獲得了良好的效果。在供體手術時，先游離切斷輸尿管，輕提輸尿管，可非常方便的分離腎后組織至腎動脈、腹主動脈，背側分支血管顯露良好，易電凝處理；腎靜脈表面處理范圍小，除腎上腺下靜脈外，需要處理的分支血管少； 僅阻斷一側腹主動脈，且使用微血管夾代替線結扎阻斷，操作方便，分離組織少，可明顯節約時間，同時也可保證能阻斷腎動脈血供，保證灌注良好。供體動脈開口使用血管片的方式留取，與文獻報道［8,9］的留取一段腹主動脈的方法相比，腹主動脈游離范圍小，處理方便，獲取簡單，且可保證足夠大的吻合口。

受體手術時，進行了以下幾個方面的改進： 使用血管夾阻斷腹腔動、靜脈，不需要分離結扎受體動靜脈的分支, 既節省時間，又不影響術后側支血管的血供。動脈受體切口不小于供體動脈血管片長徑，供體動脈開口血管片總長徑為腎動脈開口徑三倍左右； 受體靜脈切口長徑略大于供體靜脈開口直徑，吻合口均使用一端定點縫針后, 從另一端起連續縫合的方法, 控制好針距，動脈兩側各3～4針，靜脈兩側各4～5針，并在結尾處打結，既不增加血栓的發生率，又可極大的減少出血的可能。吻合血管的關鍵要看清血管內膜，進針邊距合適，如未縫到內膜將導致術后血栓形成，而邊距過大將引起吻合口狹窄； 縫線、打結時注意不要拉太緊，否則易導致吻合口狹窄。

小鼠腎移植時輸尿管的移植，因輸尿管太細而無法進行端端吻合，如果取供體時留部分輸尿管開口膀胱瓣［10,11］則操作復雜，增加供體獲取時間，且易引起吻合后膀胱瓣的缺血壞死。本實驗將輸尿管直接拉入膀胱，僅在入口處縫合固定輸尿管而使其末端游離于膀胱內，操作簡便，效果良好。

總之，小鼠腹部腎臟移植模型的建立需要熟練的顯微外科技巧和合適的手術方法，作者對手術方法關鍵之處的改進能提高手術成功率，增加模型的穩定性，易于學習掌握，值得推廣應用。

［1］Skoskiewicz M, chase C, Winn HJ, et a1. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity［J］. Transplant Proc, 1973, 5（1）：721-725.

［2］Russell PS, Chase CM, Colvin RB, et al. Kidney transplants in mice.An analysis of the immune status of mice bearing long-term H2 incompatible transplants［J］. J Exp Med, 1978, 147（5）：1449-1468.

［3］Kalina SL, Mottram PL. A microsurgical technique for renal transplantation in mice［J］. Aust N Z J Surg, 1993, 63（3）：213-216.

［4］Han WR, Murray-Segal LJ, Mottram PL. Modified technique for kidney transplantation in mice［J］. Microsurgery, 1999, 19 （6）：272-274.

［5］Zhang Z, Schlachta C, Duff J, et al. Improved techniques for kidney transplantation in mice［J］. Microsurgery, 1995, 16（2）：103-109.

［6］Martins PN. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice［J］. Microsurgery, 2006, 26（8）：590-593.

［7］Tse GH, Hughes J, Marson LP. Systematic review of mouse kidney transplantation［J］. Transpl Int, 2013, 26（12）：1149-1160.

［8］易清平, 劉小孫, 王華曦, 等. 一種小鼠腎移植模型的建立［J］. 中華實驗外科雜志, 2008, 25（11）：1517-1519.

［9］傅宇陽, 何曉順, 陳劍琳, 等. 小鼠腎移植模型的建立［J］. 中華顯微外科雜志, 2003, 26（3）：213-214.

［10］ 趙大強, 汪璐蕓, 華學鋒, 等. 小鼠腎移植模型中膀胱-膀胱吻合尿路重建術的改進［J］. 器官移植, 2013, 4（6）：362-366.

［11］ 麥海星, 曲楠, 趙立, 等. 大鼠原位腎臟移植模型的建立［J］.中國組織工程研究與臨床康復, 2011, 15（18）：3347-3350.

Improvement on Kidney Transplantation Model in Mice

HUANGJian-bing, DING Fang-bao, LIU Hao, MEI Ju
（Department of Cardiothoracic Surgery， Xinhua Hospital， Shanghai Jiao
Tong University School of Medicine， Shanghai 200092， China）

ObjectiveTo improve the technique of kidney transplantation model in mice and to increase the success rate of operation. MethodsTotally 25 pairs of C57BL/6 mice were used for kidney transplantations, and 8 C57BL/6 mice were used for control after nephrectomy. To simplify the donor kidney acquisition method, begin to separate the donor kidney from the dorsal side, reduce the separation range of the renal arteriovenous. Obtain the artery at a vascular patch. Improve the arteriovenous anastomosis technique. The donor renal artery and vein is sutured to the recipient abdominal aorta and inferior vena cava respectively by end to side anastomosis. The urethral ends of the donor were put into the recipient bladder to reconstruct the ureter, and fix the ureteral wall to the outer membrane of the bladder. The natural kidneys of the recipients were excised by two phases. ResultsThe success rate of operation was 92%, the total operation time was 47.6±8.7 min, warm ischemia time was 3～5 s, cold ischemia time was 31.1±6.3 min. ConclusionThe improvement technique of kidney transplantation model in mice can improve the success rate of operation. It is easy to learn and is worth to be widely applied.

Mice； Kidney； Transplantation； Model

Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0374-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.006牽引顯露腹腔臟器，將腸道組織置于術野左側顯露小鼠左腎。用顯微血管鑷小心游離左側輸尿管及部分輸尿管周圍脂肪, 上至左腎下極, 下至其入膀胱處,并于膀胱入口處切斷輸尿管，避免損傷輸尿管。剪開腎周脂肪囊，輕提輸尿管，沿腎背面由下往上游離左腎背側，直至腹主動脈，沿腎動脈水平上下游離腹主動脈各約0.5 cm，電凝切斷可見分支血管。放回腎臟，游離左腎靜脈開口附近腹腔靜脈，范圍往上下各約0.5 cm，并游離部分開口處腎靜脈。電凝、剪斷左腎上腺下靜脈。游離完畢，用顯微血管夾在腎靜脈水平上約0.5 cm夾閉近心端腹主動脈，在腎動脈水平下端約0.8 cm 處用30 G 針頭斜行向心穿刺腹主動脈, 緩慢灌注4 ℃肝素生理鹽水（10 U/mL） 1 mL, 可見腎臟呈蒼白色。沿腎靜脈匯入下腔靜脈處剪開腎靜脈前壁、后壁，鈍性推開腎靜脈及其周圍組織，顯露下方腎動脈開口，顯微血管剪刀于腎動脈開口下方起弧行向上剪下腎動脈開口周圍部分腹主動脈血管壁（圖1）。將腎放入4 ℃肝素生理鹽水（10 U/mL）中備用。

2015-03-17

上海市科委基金（13XD1403200）

黃健兵（1979-）, 男, 醫學博士, 主治醫師。E-mail： jb4480@163.com