PFC體內(nèi)遞增誘導建立S180腫瘤多藥耐藥模型及其穩(wěn)定性觀察

顧云浩, 曹晨潔, 胡碧原, 王　俊, 韓東冬, 許愛華

（揚州大學醫(yī)學院, 揚州　225001）

PFC體內(nèi)遞增誘導建立S180腫瘤多藥耐藥模型及其穩(wěn)定性觀察

顧云浩, 曹晨潔, 胡碧原, 王俊, 韓東冬, 許愛華

（揚州大學醫(yī)學院, 揚州225001）

目的小鼠體內(nèi)誘導建立獲得性S180多藥耐藥（multi-drug resistance, MDR）模型及其穩(wěn)定性觀察。方法模擬臨床順鉑+氟尿嘧啶+環(huán)磷酰胺（PFC）化療方案給藥, 分三個階段劑量遞增法誘導S180腹水瘤小鼠, 建立獲得性S180MDR實驗?zāi)Ｐ汀２捎绵邕蛩{（MTT）法、流式細胞術(shù)動態(tài)檢測各階段所誘導細胞對化療藥物的耐藥倍數(shù)、細胞內(nèi)藥物積累量及細胞膜P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）功能活性，并通過檢測以上指標觀察各階段所誘導細胞停藥后的耐藥穩(wěn)定性； 采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測各階段所誘導細胞MDR-1 mRNA、多藥耐藥相關(guān)蛋白-1（multidrug resistance-associated protein 1，MRP-1） mRNA的表達量。結(jié)果與親本細胞對照組比較，各階段所誘導S180細胞對化療藥物的耐藥倍數(shù)隨著誘導時間延長和劑量增高而逐漸增大, 細胞內(nèi)阿霉素（adriamycin, ADR）積累量逐漸減少, 細胞P-gp功能活性逐漸增強； 各階段所誘導S180細胞MDR-1 mRNA、MRP-1 mRNA的表達量也與誘導時間和給藥劑量呈正相關(guān)； 第一、二和三階段所誘導細胞的穩(wěn)定耐藥時間分別為1周、2周和3周左右。結(jié)論模擬臨床PFC化療方案給藥，采用分階段劑量遞增小鼠體內(nèi)誘導法可建立耐藥強度高、穩(wěn)定時間長的獲得性S180MDR實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

順鉑+氟尿嘧啶+環(huán)磷酰胺（PFC）； 多藥耐藥（MDR）； S180細胞株； 體內(nèi)；細胞膜P-糖蛋白（P-gp）； MDR-1 mRNA； 多藥耐藥相關(guān)蛋白-1（MRP-1） mRNA

腫瘤細胞多藥耐藥性（multi-drug resistance，MDR）是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生抗藥性的同時，對結(jié)構(gòu)和作用機制不同的抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性，使抗腫瘤化學治療達不到預(yù)期的臨床效果。如果在進行多個療程化療的同時合用有效的MDR逆轉(zhuǎn)劑，將有利于提高抗腫瘤化療療效。目前，雖然有很多研究文獻顯示，一些藥物在體外試驗具有很好的MDR逆轉(zhuǎn)作用［1,2］，但真正可用于臨床的逆轉(zhuǎn)劑卻很少，其主要原因之一是逆轉(zhuǎn)劑的藥效學研究大多采用體外給藥方法誘導的MDR細胞株［3-6］及其動物模型［7］，而癌癥患者MDR的形成過程是受機體各種內(nèi)環(huán)境影響的。因此, 建立接近于臨床的MDR實驗?zāi)Ｐ褪菍ふ矣行DR逆轉(zhuǎn)劑的重要基礎(chǔ)。本研究模擬臨床常用聯(lián)合化療順鉑+氟尿嘧啶+環(huán)磷酰胺（PFC）方案，體內(nèi)給藥, 采用分階段劑量遞增法誘導S180腹水瘤小鼠, 建立了獲得性S180MDR細胞株及其動物模型, 并觀察其穩(wěn)定性。

1　材料與方法

1.1動物與細胞

6～8周齡SPF級ICR小鼠, 雌雄兼用, 體質(zhì)量20±2 g, 由揚州大學比較醫(yī)學中心提供［SCXK（蘇）2012-0004］； 小鼠S180肉瘤細胞株購于中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所,體外培養(yǎng)擴增后接種于ICR小鼠腹腔內(nèi)，7～8 d傳代1次。

1.2試劑

順鉑注射液（DDP，江蘇豪森制藥股份有限公司，批號： 130603），氟尿嘧啶注射液（FU，天津金耀氨基酸有限公司，批號： H12020959），注射用環(huán)磷酰胺（CPA, 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司, 批號：13022625）, 注射用鹽酸阿霉素（ADR, 浙江海正藥業(yè)股份有限公司, 批號： 120701）, 羅丹明123（Rho123，Sigma，批號： MKBC2653V），新生牛血清（杭州四季青生物工程材料公司），青霉素（重慶市先鋒動物藥業(yè)有限公司）, 鏈霉素（江西省和光藥業(yè)有限公司），RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco），Trizol試劑盒、引物（生工生物工程上海有限公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒（TaKaRa公司）。

1.3主要儀器

超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），COIC XSZ-D2倒置顯微鏡（中國重慶光子儀器廠產(chǎn)品），ELx800型酶聯(lián)免疫檢測儀（BIO-TEK, 美國）, CO2培養(yǎng)箱（Thermo）, 分析型流式細胞儀（BD FACSCalibur）,核酸蛋白測定儀（德國Eppendorf公司），PCR儀、實時定量PCR儀（ABI公司）。

1.4小鼠體內(nèi)S180MDR模型的建立

取S180腹水瘤小鼠，無菌條件下抽取腹水，用無菌生理鹽水稀釋制成腫瘤細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細胞濃度至1×106個/mL。分別取0.2 mL細胞懸液從右下腹部注入小鼠腹腔內(nèi)，24 h后，模擬臨床常用的PFC聯(lián)合化療方案給藥，采用分階段劑量遞增誘導法。DDP, ip, 每周一次； FU, ig, 每日一次； CPA，ig, 每日一次。不同階段的給藥劑量具體如下, 第一階段： DDP 3.0 mg/kg+FU 3.0 mg/kg+CPA 3.0 mg/kg, 誘導時間為第一代和第二代； 第二階段：DDP 4.0 mg/kg+FU 6.0 mg/kg+CPA 6.0 mg/kg, 誘導時間為第三代和第四代； 第三階段： DDP 5.0 mg/kg +FU 12.0 mg/kg+CPA 12.0 mg/kg, 誘導時間為第五代和第六代。根據(jù)腹水生長的速度確定傳代時間。

1.5S180MDR模型的驗證

1.5.1噻唑藍（MTT）法測定各化療藥物的耐藥倍數(shù)取親本S180細胞和各階段誘導的S180細胞懸液, 均以1×l05/mL濃度接種于96孔培養(yǎng)板, 100 μL/孔。然后分別給予ADR、DDP和FU 6個不同濃度，每個濃度設(shè)6個復孔。實驗設(shè)空白對照組、親本細胞對照組、誘導細胞組及各濃度給藥組。37℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)44 h后，吸取上清100 μL棄之，每孔加5 mg/mL MTT 溶液10 μL，繼續(xù)孵育4 h后，每孔加鹽酸異丙醇100 μL，振蕩10 min，吹打均勻后震蕩器上充分混勻, 于自動酶標儀490 nm波長下測定吸光度值，計算細胞生長抑制率、半數(shù)抑制濃度（IC50）和耐藥倍數(shù)。細胞生長抑制率= （1-實驗組吸光度/對照組吸光度） ×100%； 耐藥倍數(shù)=誘導細胞IC50/親本細胞IC50。

1.5.2流式細胞術(shù)測定細胞內(nèi)ADR積累量收集親本S180細胞和各階段所誘導的S180細胞，用含5 μg/mL ADR的 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞至細胞數(shù) 1×106/mL, 分別接種于 24孔板, 每孔終體積為2 mL, 每組3個平行樣品。37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱條件下溫育3 h，然后用3 mL左右的冷PBS吹洗，反復3次。最后用1 mL冷PBS液制成懸液于流式細胞管內(nèi)，吹散細胞，立即用流式細胞儀檢測10 000個細胞內(nèi)ADR的平均熒光強度（MFI）。結(jié)果以MFI代表細胞內(nèi)ADR濃度。ADR選用激發(fā)波長488 nm, 發(fā)射波長575 nm。

1.5.3流式細胞術(shù)測定細胞膜P-糖蛋白的功能采用Rho123蓄積和泵出實驗檢測親本與耐藥細胞膜上P-糖蛋白（P-gp）活性的差別［8,9］。測定 Rho123在細胞內(nèi)的蓄積時，收集親本S180細胞和各階段所誘導的S180細胞，用含2.0 μg/mL Rho123的 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞至細胞數(shù) 1×106/mL， 分別接種于 24 孔板, 每孔終體積為1.0 mL, 每組3個平行樣品。在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱條件下溫育3 h, 然后用3.0 mL左右的冷PBS吹洗, 反復3次。最后用1.0 mL冷PBS液制成懸液于流式細胞管內(nèi), 吹散細胞, 立即用流式細胞儀檢測10 000個細胞內(nèi)Rho123的MFI。結(jié)果以MFI代表細胞內(nèi)Rho123濃度。

測定 Rho123 在細胞內(nèi)的泵出時, 收集親本S180細胞和各階段所誘導的S180細胞，用含2.0 μg/mL Rho123的 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞至細胞數(shù) 1×106/mL，分別接種于 24 孔板，每孔終體積為1.0 mL，每組3個平行樣品。在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱條件下溫育2 h，然后用3.0 mL左右的冷PBS反復吹洗2次，重懸于不含Rho123的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，用冷PBS吹洗2次后, 最后用1.0 mL冷PBS液制成懸液于流式細胞管內(nèi), 吹散細胞, 立刻用流式細胞儀檢測10 000個細胞內(nèi) Rho123的MFI。結(jié)果以MFI代表細胞內(nèi)Rho123濃度。Rho 123選用的激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm。

1.5.4RT-qPCR測定MDR-1 mRNA與MRP-1 mRNA的表達量采用RT-qPCR法檢測細胞內(nèi)MDR-1 mRNA和MRP-1 mRNA的表達量。目的基因MDR-1的上游引物： 5c -ATGACACCCCTGAAATCCA-3c, 下游引物： 5c-CGCTCCTGTGGTGTTTTTA-3c, 擴增產(chǎn)物為215 bp； 目的基因MRP-1的上游引物： 5c-CCTACTACCCCAGCATTGT-3c, 下游引物： 5c-TATTCCTTCAGTCTCTCCAC-3c, 產(chǎn)物擴增片段238 bp；內(nèi)參GAPDH的上游引物：5c-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3c, 下游引物：5c-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3c，擴增產(chǎn)物為450 bp。取親本細胞和各階段誘導的S180細胞，采用TRizo1法分別提取細胞中 RNA，測定終溶液中D260/D280與RNA濃度。按兩步法 RT-qPCR 試劑盒操作說明反轉(zhuǎn)錄得到cDNA, 并進行SYBR Green法熒光定量PCR分析各基因的表達。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為（1） 37℃ 15 min；（2）85 ℃ 5 s, 然后冷卻至4 ℃； PCR反應(yīng)條件為（1） 95℃預(yù)變性30 s； （2） 95 ℃，5 s； （3）60 ℃, 34 s； 共40個循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，進行熔解曲線實驗，條件為95℃, 15 s； 60℃, 1 min； 95℃, 15 s。最終結(jié)果用2-△△Ct法進行各基因表達的相對定量分析。1.6S180MDR模型的穩(wěn)定性觀察

將各階段細胞末次傳代后, 停止給予化療藥物，正常飼養(yǎng)、傳代, 分別在停藥1、2或3周時，取各階段所誘導細胞，按1.5.1、1.5.2、1.5.3項下方法，測定細胞對各化療藥物的耐藥倍數(shù)、細胞內(nèi)ADR含量及細胞膜P-gp功能活性。

1.7統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0分析軟件進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)用±s表示，兩樣本之間采用t檢驗，多樣本之間采用單因素方差分析進行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1細胞的耐藥倍數(shù)

隨著誘導時間延長和劑量增大，各階段所誘導的S180細胞對各化療藥物的耐藥倍數(shù)逐漸增大（表1），提示本實驗體內(nèi)建立耐藥細胞株的方法可以使敏感型細胞獲得耐藥性。根據(jù)Sonw［10］等標準（耐藥倍數(shù)＜5為低度耐藥，5～15為中度耐藥，＞15為高度耐藥），第一階段誘導的細胞為低度耐藥，而第二、三階段的可達到中度耐藥； 表1結(jié)果還顯示，所誘導的S180細胞對ADR也具有一定的耐藥性，提示其對結(jié)構(gòu)不同的其他化療藥物也產(chǎn)生了耐藥性，具有MDR的特點。表2結(jié)果顯示，第一階段所誘導的S180細胞停藥1周時對各化療藥物的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)皆＞1.0，但停藥2周時除了FU, 對其它化療藥物的耐藥倍數(shù)皆＜1.0, 提示其耐藥穩(wěn)定期只能維持1周； 第二階段、第三階段所誘導的S180細胞停藥后其耐藥穩(wěn)定期則分別為2周和3周； 表2結(jié)果還顯示，同期比較，停藥2周時，第二、三階段細胞各耐藥倍；數(shù)均明顯高于第一階段的，停藥3周時，第三階段的耐藥倍數(shù)均略高于第二階段的，顯示其誘導時間、誘導劑量與所誘導的S180細胞在停藥后對各化療藥物的耐藥強度和穩(wěn)定性具有一定的正相關(guān)關(guān)系。

2.2細胞內(nèi)ADR的積累量

藥物在細胞內(nèi)的積累量是其發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。與親本細胞相比，藥物在耐藥細胞內(nèi)的積累量會有所減少。圖1結(jié)果顯示, 各階段所誘導的S180細胞內(nèi)ADR的積累量隨著誘導時間延長、劑量增大而逐漸減少, 與相應(yīng)親本細胞的比較均具有顯著性差異。圖2結(jié)果顯示, 第一階段在停藥1周和2周時與相應(yīng)的親本細胞比較，所誘導細胞內(nèi)ADR的積累量也均有所減少（P＜0.001和P＜0.05）, 但停藥1周的減少更明顯； 各階段在停藥2周時除了所誘導細胞內(nèi)ADR的積累量顯著減少, 還顯示其減少程度與誘導劑量和時間具有一定的正相關(guān)關(guān)系； 第二、三階段停藥3周時細胞內(nèi)ADR積累量也皆有所減少，但第二階段的與親本細胞比較沒有統(tǒng)計學差異。

表 1　各階段細胞對各化療藥物的耐藥倍數(shù)（n=6）

表 2　各階段誘導細胞停藥后耐藥倍數(shù)測定（n=6）

2.3P-gp的功能活性

圖1　各階段細胞內(nèi)ADR的積累量

圖2　各階段停藥后細胞內(nèi)ADR的積累量

Rho123是特異性較強的P-gp底物，通過檢測細胞對Rho123的蓄積和泵出反映其P-gp功能活性強弱。圖3結(jié)果顯示，各階段所誘導的S180細胞對Rho123的蓄積量隨著誘導時間延長、給藥劑量增大而逐漸減少（圖3A），而對Rho123的泵出量則逐漸增多（圖3B），分別與相應(yīng)的親本細胞對照組比較均具有顯著性差異，表明經(jīng)過各階段體內(nèi)誘導的S180細胞P-gp功能活性逐漸增強，即產(chǎn)生了不同程度的MDR。圖4結(jié)果顯示, 各階段停藥后的不同時間, 所誘導細胞內(nèi)Rho123的蓄積量仍然均低于親本細胞對照組（圖4A），而泵出量則反之（圖4B），除了第一階段停藥后第二周和第二階段停藥后第三周的, 皆具有統(tǒng)計學意義。提示所誘導的細胞在停藥后的一段時間仍然具有不同程度的耐藥穩(wěn)定性，該穩(wěn)定性與誘導劑量和時間具有一定的正相關(guān)。

2.4細胞MDR-1 mRNA和MRP-1 mRNA表達量用核酸蛋白測定儀測定提取的RNA溶液D260/ D280值, 結(jié)果為1.6～1.8, 然后調(diào)節(jié)濃度后采用RT-qPCR法分別檢測親本S180細胞與不同階段所誘導的S180

圖3　各階段細胞內(nèi)Rho123蓄積量（A）和泵出后細胞內(nèi)剩余量（B）

圖4　各階段停藥后細胞內(nèi)Rho123的蓄積量（A）和泵出后細胞剩余量（B）

圖5　2-△△Ct法進行各基因表達的相對定量分析過程

表 3　各階段細胞中MDR-1mRNA和MRP-1mRNA的表達量（n=3）

3　討論

圖6　各階段細胞MDR-1 mRNA和GAPDH擴增產(chǎn)物的熔解曲線

模擬PFC聯(lián)合化療給藥方案, 通過小鼠體內(nèi)誘導MDR細胞株的研究已有一些報道［11］, 但由于所用化療藥物大多劑量偏低，因而所建立的耐藥細胞株其耐藥強度不高，耐藥穩(wěn)定持續(xù)時間較短, 僅1周左右［12］, 而大多中藥逆轉(zhuǎn)劑起效較慢, 故現(xiàn)有MDR實驗?zāi)Ｐ筒惶m合中藥或植物提取物類逆轉(zhuǎn)劑的研細胞中MDR-1 mRNA和MRP-1 mRNA的表達量, 各基因表達的相對定量結(jié)果用2-△△Ct法進行分析（圖5）。表3結(jié)果顯示, 三個階段所誘導細胞中MDR-1 mRNA、MRP-1 mRNA的表達量均高于親本細胞, 除了第一階段的MDR-1, 皆具有統(tǒng)計學差異； 結(jié)果還顯示各階段所誘導細胞的基因表達量與誘導藥物的給藥時間和劑量呈正相關(guān)關(guān)系。圖6、圖7的熔解曲線分析顯示兩種細胞MDR-1 mRNA、MRP-1 mRNA及GAPDH的PCR產(chǎn)物均為單一峰, 沒有其他雜質(zhì)峰出現(xiàn), 可知采用SYBR Green 法熒光定量PCR 分析各基因的表達時, 熒光信號全部為PCR擴增產(chǎn)物, 無引物二聚體及干擾非特異性產(chǎn)物的干擾。究。此外, 有些實驗?zāi)Ｐ停?3］未報道耐藥穩(wěn)定性考察結(jié)果, 或是考察時間較短, 因而影響模型復制的成功率。本實驗?zāi)Ｐ驮谝延蠵FC方案基礎(chǔ)上進行了改進, 體內(nèi)給藥，采用分階段劑量遞增法誘導腫瘤細胞耐藥, 其中DDP為3/4/5 mg/kg, FU和CPA均為3/6/12 mg/kg, 并動態(tài)檢測各階段誘導細胞的相關(guān)耐藥指標, 觀察隨著劑量遞增其耐藥強度的變化趨勢。結(jié)果顯示, 隨著PFC化療藥物劑量遞增, 所誘導的S180細胞耐藥強度逐漸增強, 并能耐受所用化療藥物的臨床最高給藥劑量, 提示被誘導細胞具有較高強度的耐藥性。各穩(wěn)定性實驗結(jié)果相互驗證, 均顯示第一階段誘導細胞的耐藥穩(wěn)定時間維持在1周左右,而第二、三階段則分別在2周和3周左右, 提示該實驗?zāi)Ｐ湍退帍姸雀? 穩(wěn)定性好, 且耐藥強度與穩(wěn)定性與誘導時間和給藥劑量呈正相關(guān), 中藥及其提取物的逆轉(zhuǎn)劑建議使用第二、三階段所誘導的細胞。

圖7　各階段細胞MRP-1 mRNA和GAPDH擴增產(chǎn)物的熔解曲線

研究表明MDR產(chǎn)生的機制與P-gp、MRP-1等多藥耐藥蛋白密切相關(guān)［14,15］。其中P-gp［16］為由mdr-1編碼的ATP依賴性藥物排出泵，MRP［17］是一種谷光甘肽-S的共軛轉(zhuǎn)運泵, 它們皆可利用ATP提供的能量將胞內(nèi)抗腫瘤藥物轉(zhuǎn)運至胞外使抗腫瘤作用減弱, 其相關(guān)變化反應(yīng)細胞耐藥性的產(chǎn)生及其強度。本研究對所建模型動態(tài)測定不同階段所誘導的S180細胞對化療藥物的耐藥倍數(shù)、細胞ADR的蓄積量及P-gp功能活性, 并同步測定細胞MDR-1 mRNA、MRP-1 mRNA的表達量，以通過多指標相互驗證各階段細胞的耐藥性。其中耐藥倍數(shù)以藥效的形式驗證所誘導細胞對各化療藥物的敏感性, ADR的蓄積量反映化療藥物進入腫瘤細胞內(nèi)的多少, P-gp功能活性從蛋白層面驗證所誘導細胞外排藥物的能力, 而MDR-1 mRNA、MRP-1mRNA表達量則從基因?qū)用骝炞C所誘導細胞的耐藥特性。結(jié)果顯示, 所建模型細胞不僅對DDP、FU產(chǎn)生了較強的耐藥性, 且對未接觸過的、結(jié)構(gòu)和作用機制不同的ADR也具有一定程度的交叉耐藥性, 因而具有MDR特點。從具體結(jié)果來看, 隨著劑量增大, 各階段細胞對DDP、FU、ADM的耐藥倍數(shù)由最初的1.61、1.06、0.93增大到7.41、5.85、4.25；細胞內(nèi)ADR的積累量逐漸減少, 而細胞P-gp功能活性則逐漸增強； MDR-1 mRNA、MRP-1 mRNA的表達量也與誘導時間和給藥劑量正相關(guān)。

綜上所述, 本實驗?zāi)Ｐ蛣討B(tài)、同步檢測的各項指標結(jié)果相互得到了驗證, 一致提示了該MDR模型耐藥強度高、穩(wěn)定時間長, 具有較強的可行性和實用性，為相關(guān)逆轉(zhuǎn)劑的研究提供了較理想的動物體內(nèi)MDR模型建立方法，具有重要實踐應(yīng)用價值。

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Establishment of S180 Tumor Multidrug Resistance Mouse Model by Increasing PFC and Observation on Stability

GU Yun-hao, CAO Chen-jie, HU Bi-yuan, WANG Jun, HAN Dong-dong, XU Ai-hua
（Medical College， Yangzhou University， Yangzhou 225001， China）

ObjectiveTo establish aquired S180 multidrug resistance （MDR） mouse model and study on its stability. MethodsTo mimic the clinical PFC （cis-Dichlorodiamineplatinum+5-Fluorouracil+cyclophosphamide） scheme, gradually increase the dose in three phases to induce S180 ascites tumor mice and establish the aquired S180 MDR mouse model. The induced cells resistance factor to the chemotherapeutics drugs in different stages, the accumulation of adriamycin （ADR） and the functional activity of P-glycoprotein （P-gp） were detected by MTT assay and flow cytometry. And then through detecting the above indicators to monitor the resistance drug stability of induced cells in different stages. The mRNA expression of MDR-1 and multidrug resistance-associated protein 1 （MRP-1） of induced cells in different stages were detected by real time quantitative PCR （RT-qPCR）. ResultsCompared with the parent cells, with induction time extending and dose increasing, the resistance factors in each stage of induced S180 cells tochemotherapeutics drugs were gradually increased, the accumulation of ADR was gradually reduced, and the functional activity of P-gp was strengthened.The mRNA expression of MDR-1 and MRP-1 of induced cells in different stages had a positive correlation to the induction time and dose. The stable resistance time of induced cells in the first, second and third phase are respectively for about 1 week, 2 weeks and 3 weeks. ConclusionTo mimic the clinical PFC scheme, using the dose gradually increasing by phased can establish a high resistant strength, long stable time aquired S180MDR experimental model.

cis-Dichlorodiamineplatinum+5-Fluorouracil+cyclophosphamide （PFC）； Multidrug resistance；S180 cell line； in vivo； P-gp； multidrug resistance-1（MDR-1mRNA）；multidrug resistance-associated protein-1（MRP-1 mRNA）

Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0367-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.005

2015-03-03

揚州大學大學生科技創(chuàng)新基金項目（2014）； 江蘇省醫(yī)藥高技術(shù)研究項目（BG2007609）

顧云浩（1994-）, 男, 揚州大學醫(yī)學院2012級在讀本科生。E-mail： 907745184@qq.com

許愛華（1957-）, 女, 教授, 主要從事腫瘤藥理學研究。 E-mail： ahxu@yzu.edu.cn