二袖套法大鼠原位肝移植手術(shù)技巧探討

張　杰, 都　敏, 鮑　興, 戴璟瑜, 閻玉礦, 彭海峰

（1. 深圳市第九人民醫(yī)院, 深圳　518116；　2. 深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院, 深圳　518172）

·經(jīng)驗(yàn)交流·

二袖套法大鼠原位肝移植手術(shù)技巧探討

張杰1, 都敏1, 鮑興1, 戴璟瑜1, 閻玉礦1, 彭海峰2

（1. 深圳市第九人民醫(yī)院, 深圳518116；2. 深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院, 深圳518172）

目的探討二袖套法建立大鼠原位肝移植模型的外科技巧。方法在Kamada二袖套法基礎(chǔ)上, 對(duì)供體靜脈處理, 受體門(mén)靜脈、肝上下腔的處理等手術(shù)方法作了改進(jìn)。結(jié)果共建立50例大鼠原位肝移植模型,手術(shù)成功率92%, 7d存活率達(dá)88%。結(jié)論在嫻熟細(xì)致的外科操作基礎(chǔ)上，精簡(jiǎn)術(shù)式，改進(jìn)細(xì)節(jié)，可成功的建立起大鼠肝移植模型。

原位肝移植； 二袖套法； 動(dòng)物模型； 大鼠

建立大鼠肝移植模型是缺血-再灌注損傷、排斥反應(yīng)以及免疫耐受研究的有效手段。自1979 年Kamada等［1］報(bào)道二袖套法后, 許多研究者［2-4］進(jìn)行了各種改良, 并結(jié)合自己的體會(huì)建立了穩(wěn)定的大鼠肝移植模型。本實(shí)驗(yàn)采用Kamada “二袖套法”［5］, 結(jié)合國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)（表1）, 成功地建立了穩(wěn)定的大鼠肝移植模型, 結(jié)合自己的實(shí)踐體會(huì),闡述如下：

1　材料與方法

1.1材料

清潔級(jí)雄性SD大鼠100只, 體質(zhì)量180～250 g,購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK（粵）2013-0034］。受體體質(zhì)量略重于供體。下腔靜脈和門(mén)靜脈套管均選用靜脈留置針14 G內(nèi)徑2.2 mm, 長(zhǎng)2.5 mm均留有尾翼, 膽管支架采用靜脈留置針24 G, 長(zhǎng)3～4 mm, 兩端削成銳角。自制拉鉤2個(gè)，一大塊橡皮泥, 上海手術(shù)器械廠顯微外科手術(shù)器械包,絲線,灌注液： 0～4 ℃肝素等滲鹽水（100 U/mL）, 保存液： 含肝素25 U/mL的4 ℃乳酸鈉林格氏液, 乙醚麻醉筒。

1.2方法

1.2.1術(shù)前準(zhǔn)備選擇健康活潑的大鼠, 受體、供體大鼠禁食8～12 h，自由飲水。

1.2.2 供體手術(shù) 術(shù)前30 min皮下注射的阿托品0.4 mL/kg。體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛0.3 mL/kg, 腹腔注射，腹正中切口進(jìn)腹, 經(jīng)陰莖背靜脈注射肝素生理鹽水2 mL（含肝素100 U/mL）, 供肝的游離時(shí)很難避免按壓它從而造成肝臟的缺血再灌注損傷［6］, 故用濕棉簽或濕紗布向下?tīng)恳闻K, 解剖第二肝門(mén)： 游離肝臟周韌帶, 縫扎左膈肌靜脈。解剖肝下下腔靜脈（subhepatic inferior vena cava, IVC）, 結(jié)扎切斷右腎上腺靜脈。游離右腎靜脈水平以上的肝下下腔靜脈, 游離右腎靜脈結(jié)扎切斷。解剖第一肝門(mén)： 游離膽總管, 自膽總管中、下1/3 處向上V 形剪開(kāi)前壁,向肝側(cè)插入膽管支架管, 5-0絲線固定后, 遠(yuǎn)端離斷膽管。分離結(jié)扎切斷肝固有動(dòng)脈, 游離肝門(mén)靜脈至脾靜處結(jié)扎并剪斷, 留線尾待以后套扎用,適當(dāng)壓力注入灌注液15 mL 經(jīng)肝門(mén)靜脈（portal vein, PV）灌洗肝臟。灌注速度控制在3～4 mL/min, 均勻低壓, 以肝臟不腫脹為宜［7］, 灌注壓力過(guò)高可引起肝細(xì)胞損傷,導(dǎo)致肝細(xì)胞水腫進(jìn)而影響供肝質(zhì)量［8］。于左腎靜脈以下剪斷下腔靜脈, 以便灌洗液順利流出, 使供肝迅速進(jìn)入冷缺血狀態(tài)。灌注同時(shí)稍向左側(cè)牽拉胃底,暴露肝食管韌帶內(nèi)的血管交通支,結(jié)扎切斷。待肝臟變成土黃色后,剪斷肝下下腔靜脈和門(mén)靜脈, 殘端盡量留長(zhǎng)。輕輕下?tīng)扛? 用眼科剪剪下肝上下腔靜脈, 不帶膈肌組織。取出肝, 置于0～4℃保存液里。

1.2.3 受體手術(shù) 術(shù)前30 min按0.4 mL/kg皮下注射阿托品,乙醚吸入麻醉成功后,臥位固定，背部墊高約1 cm,切口同供體，游離肝周韌帶，靠近膈肌結(jié)扎切斷左膈肌靜脈。第一肝門(mén)分離出膽總管，在左右肝管分叉處結(jié)扎切斷膽總管，分離肝固有動(dòng)脈并結(jié)扎切斷, 分離門(mén)靜脈至左右支分叉處（圖1）。分離肝下下腔靜脈，連同軟組織結(jié)扎腎上腺靜脈不剪短結(jié)扎線，留作套管時(shí)牽引用。將肝臟翻向左側(cè)，離斷肝后韌帶至膈下。血管夾阻斷肝下下腔靜脈。血管夾阻斷門(mén)靜脈并用體積分?jǐn)?shù)1%的溫碳酸氫鈉2.0 mL經(jīng)門(mén)靜脈左右分支處注入驅(qū)趕肝內(nèi)血液，即所謂“自體輸血”［9］并在分叉處剪一小口，留做供體袖套置入。以Satinsky鉗貼膈肌夾閉肝上下腔靜脈,緊貼受體肝臟剪斷肝上下腔靜脈及在肝門(mén)處剪斷門(mén)靜脈左右分支，連同部分肝組織剪斷肝下下腔靜脈，取出肝臟。

1.2.4 原位肝移植 取出供肝置于原位, 適當(dāng)調(diào)整位置，將肝臟向頭側(cè)翻起, 將門(mén)靜脈左右分支的預(yù)置線做牽引。7-0預(yù)置縫線連續(xù)縫合肝上下腔靜脈?？p完最后一針與第一針尾線打結(jié)前，用2 mL等滲鹽水排凈吻合口中空氣，再打結(jié)?？焖賹⒐w門(mén)靜脈袖套插入門(mén)靜脈，用5-0絲線固定,開(kāi)放門(mén)靜脈，待部分血液從肝下下腔流出時(shí)開(kāi)放肝上下腔靜脈，結(jié)束無(wú)肝期。結(jié)束無(wú)肝期前將各葉輕撥復(fù)位，防止出現(xiàn)肝葉充盈不均或淤血，達(dá)到真正的“原位肝移植”［10］。此時(shí)快速將肝下下腔靜脈袖套插入肝下下腔靜脈，用5-0絲線固定。熟練和完善的手術(shù)步驟是縮短無(wú)肝期時(shí)間的基礎(chǔ)。最后, 將供肝膽總管支撐管插入膽總管中, 結(jié)扎固定。擦凈腹腔內(nèi)少許積血, 左側(cè)腰靜脈推注等滲鹽水2.5 mL,喂以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%葡萄糖水，1 d后進(jìn)流食。

2　結(jié)果

自2013年6月～2014年3月，共施行大鼠原位肝移植50對(duì)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如下： 供體手術(shù)約39 ± 2 min, 受體手術(shù)時(shí)間54±4 min, 受體無(wú)肝期16± 2 min, 供肝修整時(shí)間13±2 min, 移植物冷缺血時(shí)間約55 min。手術(shù)成功率（手術(shù)成功判定標(biāo)準(zhǔn)： 以大鼠關(guān)腹去除固定后能自行翻身、精神好、主動(dòng)進(jìn)水、對(duì)刺激反應(yīng)正常、存活24 h以上）為92%（46/50）, 其中1例死于肝上下腔靜脈漏血, 1例死于門(mén)靜脈扭曲,1例死于膽漏, 1例死于肝下下腔開(kāi)放時(shí)血栓栓塞。7 d后存活率88% （44/50）, 2例為膽管阻塞。

表 1　本實(shí)驗(yàn)操作在Kamada實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上主要改進(jìn)之處

圖1　手術(shù)操作示意圖

3　討論

成功建立大鼠原位肝移植模型無(wú)論是在臨床實(shí)驗(yàn), 還是在基礎(chǔ)研究中都具有重要意義, 然而此手術(shù)操作程序的復(fù)雜, 無(wú)肝期操作時(shí)間的有限, 在很大程度上限制了大鼠肝臟移植模型快速成功建立和廣泛推廣［11］。作者經(jīng)過(guò)接近1年實(shí)踐，在供體靜脈處理，受體門(mén)靜脈、肝上下腔靜脈吻合等方面做了改進(jìn)，可單人直視下操作，操作簡(jiǎn)單, 成功率高。

3.1供體靜脈處理

注意事項(xiàng)包括： ①結(jié)扎右腎上腺靜脈： 連同血管周?chē)M織一同結(jié)扎，這樣避免了反復(fù)翻動(dòng)尾葉，肝臟質(zhì)地很脆，避免出血。②左膈靜脈處理： 左膈靜脈與下腔靜脈距離很近，將肝臟向下?tīng)恳龝r(shí)，在吸氣時(shí)，用顯微鑷子將二者分開(kāi)，帶線結(jié)扎。初學(xué)者很容易損傷肝上下腔靜脈，破裂出血，手術(shù)失敗。③肝上下腔靜脈的處理： 在處理肝上下腔靜脈時(shí)，分離肝后韌帶至膈下, 有時(shí)下腔靜脈與食管關(guān)系緊密, 下腔靜脈管壁薄, 應(yīng)在食管上方用頓彎鉗以一定的角度垂直下腔靜脈分離, 否則容易分破下腔靜脈出血, 膈肌破裂造成氣胸。肝上下腔靜脈的修整時(shí)要與左膈肌靜脈為標(biāo)志，還要保證要有足夠的邊緣以便于血管的吻合［12］。④門(mén)靜脈： 分離至脾靜脈, 留結(jié)扎線, 這樣即可保留足夠門(mén)靜脈長(zhǎng)度，又可以在作套管時(shí)作牽引線和辨別門(mén)靜脈前后壁，避免門(mén)靜脈扭轉(zhuǎn)。⑤手術(shù)順序合理化： 利用灌注期間的時(shí)間處理肝食管之間的交通血管、使游離與灌注兩手術(shù)階段重疊進(jìn)行, 明顯縮短了手術(shù)時(shí)間。

3.2 受體靜脈處理

注意事項(xiàng)包括： ①門(mén)靜脈的處理： 受體肝摘除時(shí),通過(guò)在門(mén)靜脈左右分支分別用5-0絲線結(jié)扎,在分支近肝側(cè)剪斷左右支，帶線以做牽引，并在分叉處縱形切開(kāi)前壁約2 mm，容易將供體門(mén)靜脈袖套置入，Hans等［13］處理門(mén)靜脈平均時(shí)間4 min，本實(shí)驗(yàn)平均時(shí)間4±0.3 min，成功率98%。②肝上下腔的處理： 肝上下腔靜脈的吻合占無(wú)肝期的大部分,要求吻合速度快，吻合口不漏血，不狹窄。因此，一定要準(zhǔn)確區(qū)分受體肝上下腔靜脈前后壁層次。左側(cè)角吻合時(shí)，準(zhǔn)確辨認(rèn)側(cè)角（以左膈肌靜脈結(jié)扎線為標(biāo)志）。進(jìn)針點(diǎn)應(yīng)偏向后壁, 在肝臟重力牽來(lái)作用下，很容易暴露后壁，再開(kāi)始縫合后壁。進(jìn)針準(zhǔn)確, 切忌反復(fù)操作, 易引起出血和撕裂血管。

總之，建立一個(gè)穩(wěn)定的大鼠原位肝植模型并非易事，除了術(shù)者應(yīng)掌握嫻孰的顯微外科技術(shù)外，還要有堅(jiān)強(qiáng)的意志品質(zhì)，不斷的實(shí)踐，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)。本實(shí)驗(yàn)手術(shù)方法具有相對(duì)簡(jiǎn)單無(wú)肝期短、手術(shù)成功率高、是大鼠原位肝移植的理想術(shù)式。

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Probe on Orthotopic Liver Transplantation in Rats by Double- Cuff Technique

ZHANGJie1, DOUMin1, BAOXing1, DAI Jin-yu1, YAN Yu-kuang1, PENGHai-feng2
（1. Department of General Surgery， the Ninth People's Hospital of Shenzhen， Shenzhen 518116， China；2. Longgang District People's Hospital，Shenzhen 518172， China）

ObjectiveTo investigate the surgical techniques for establishing the rat model of orthotopic liver transplantation. MethodsOn the basis of the double-cuff technique of Kamada, Some of the skills of the techniques for the veins of donors and the portal vein and the suprahepaticinferior vena cava of recipients were modified. ResultsOf the 50 rats that underwent orthotopic liver transplantation, 92% survived longer than 24 hours and 88% over 7 days. ConclusionThe operator can successfully establish the rat model of orthotopic liver transplantation by streamline operations and improving the details on the basis of skillful surgical techniques.

Orthotopic liver transplantation； Double-cuff technique； Animal model； Rat

Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0406-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.013

2015-02-14

深圳市創(chuàng)新計(jì)劃（JCYJ20140411150159437）

張杰（1974-）, 男, 碩士, 副主任醫(yī)師, 從事肝膽外科專(zhuān)業(yè)。E-mail： 15811831077@163.com