dl -扁桃酸陰道熱敏凝膠劑對小型豬陰道黏膜刺激性的研究

夏敏杰, 黃　超, 田　芳, 王玉柱, 職瑞娜,2, 丁訓城, 嚴錢勤, 李衛華

（1. 上海市計劃生育科學研究所, 國家計劃生育藥具重點實驗室, 上海　200032；

2. 復旦大學公共衛生學院, 上海　200032；　3. 上海市第六人民醫院, 上海　200233）

dl -扁桃酸陰道熱敏凝膠劑對小型豬陰道黏膜刺激性的研究

夏敏杰1, 黃超1, 田芳1, 王玉柱1, 職瑞娜1,2, 丁訓城1, 嚴錢勤3, 李衛華1

（1. 上海市計劃生育科學研究所, 國家計劃生育藥具重點實驗室, 上海200032；

2. 復旦大學公共衛生學院, 上海200032；3. 上海市第六人民醫院, 上海200233）

目的研究dl-扁桃酸陰道熱敏凝膠劑對小型豬陰道黏膜的刺激性。方法將9只雌性小型豬按體質量隨機分為空白膠組、dl-扁桃酸陰道熱敏凝膠劑組和市售壬苯醇醚凝膠（N-9凝膠）組, 肌肉注射苯甲酸雌二醇400 μg/kg（促發情）, 12 d后建立小型豬陰道刺激性試驗模型，陰道給予5 mL凝膠, 每日一次, 連續給藥7 d, 在給藥前和末次給藥后的24 h與72 h，收集陰道灌流（CVL）液, 流式細胞儀計數炎性細胞和中性粒細胞數目； 末次給藥72 h后處死小型豬, 取陰道組織, 觀察陰道黏膜組織病理學改變。結果dl-扁桃酸陰道熱敏凝膠劑組CVL液中炎性細胞、中性粒細胞數目明顯低于N-9 凝膠組（P＜0.05）。小型豬陰道黏膜組織HE染色顯示, dl-扁桃酸陰道熱敏凝膠劑處理組陰道黏膜無明顯上皮破損、血管充血以及炎癥細胞浸潤, 其刺激性評分（5.10±0.47）, 與空白膠組（3.30±1.60）比較無顯著性差異（P＞0.05），明顯低于N-9 凝膠組（20.50±3.50）（P＜0.05）。結論dl-扁桃酸陰道熱敏凝膠劑對小型豬陰道黏膜刺激性較小。

dl-扁桃酸陰道熱敏凝膠劑； 小型豬； 炎性細胞； 中性粒細胞

長期以來，國內外通常選用家兔陰道刺激性模型（rabbit vaginal irritation，RVI）來評價外用避孕藥的陰道黏膜刺激性，并以此作為臨床前安全性評價的標準模型［1］。但RVI模型具有明顯局限性，首先，家兔陰道解剖學結構與人差異明顯，其次，RVI模型對大部分人源生殖道病原體不敏感，并且它并不能準確反映出黏膜上皮炎癥因子的變化和免疫細胞的活化情況［2］。

小型豬與人類陰道無論是在組織學、亞細胞結構甚至滲透性方面都有著較多相似之處，因此可將小型豬作為一種新的評估陰道黏膜刺激的合適模型［3］。此外，小型豬模型可以提供對陰道灌流液中免疫細胞活化狀態和細胞因子釋放進行動態細致的檢測與分析，使其成為一個良好的人類陰道組織替代品［3］。

本課題組前期探索研究表明，dl-扁桃酸可能具有較強的體外抑制精子的活性，它通過影響精子頂體和降低線粒體膜電位，引發精子運動障礙，從而對精子起到制動作用。dl-扁桃酸陰道熱敏凝膠劑（dl-Mandelic acid thermosensitive in situ gel，dl-Mandelic acid-TISG, 以下簡稱dl-扁桃酸凝膠）是以dl-扁桃酸為主藥的一種新型熱敏型酸性水溶性凝膠（pH 3.5～3.9）, 一方面依靠dl-扁桃酸自身良好的抑精作用，另一方面依靠凝膠系統自身具有的酸緩沖作用，維持陰道正常酸性微環境和微生態平衡，從而達到制動精子和抑制病原微生物的殺精避孕目的。本文將以小型豬為動物模型, 市售N-9 凝膠為陽性對照, 評價dl-扁桃酸凝膠的陰道刺激性作用。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

dl-扁桃酸（mandelic acid, 純度≥95%, 購自上海貝合化工有限公司）； 泊洛沙姆407（Poloxamer 407, P4 0 7, 德國BAS F公司）； 羥丙甲基纖維素（HPMCK4M, 美國DOVV公司）； 苯甲酸雌二醇注射液（上海通用藥業股份有限公司）； 市售壬苯醇醚膠劑（N-9 凝膠）商品名“樂樂迷”，凝膠中含N-9 40 mg/mL（中國藥科大學制藥有限公司）。熒光分選細胞儀（FACS Calibur型，美國Becton Dicknson公司），病理顯微鏡（C31，日本Olympus公司）。

1.2dl -扁桃酸凝膠的制備

稱取一定量的dl-扁桃酸和熱敏凝膠基質泊洛沙姆407, 加入0.1 mol/L醋酸緩沖液（pH=3.5）, 于磁力攪拌器下使其分散均勻，然后置4 ℃冰箱中冷藏12 h, 使dl-扁桃酸凝膠充分溶解、均勻分散至無色透明狀態, 最后配置成dl-扁桃酸濃度為5 mg/mL的熱敏凝膠劑，其pH為3.5～3.9, 且能隨外界溫度由液狀（溫度≤ 28 ℃）轉變為凝膠狀（溫度≥ 32 ℃）。

1.3實驗動物及飼養條件

成年雌性廣西巴馬小型豬9只, 體質量35～40 kg,購自上海浦東新區華新特種養殖場［SCXK（滬）2012-0013］。飼養于上海市第六人民醫院普通級動物房［SYXK（滬）2011-0128］, 溫度為（25±3） ℃, 12 h/12 h明暗周期，動物食用標準顆粒飼料，自由飲水。

1.4陰道黏膜刺激性試驗（pig vaginal irritation，PVI）［4］

9只雌性小型豬, 適應環境2周后，按體質量隨機分成3組： ①空白膠組（無藥熱敏凝膠 5 mL/d）；②N-9 凝膠組（N-9 凝膠25 mg/d）； ③dl-扁桃酸凝膠組（dl-扁桃酸凝膠25 mg/d）。每組3只，給藥前小型豬肌肉注射苯甲酸雌二醇400 μg/kg促發情，同步各組小型豬發情周期。苯甲酸雌二醇注射后的12 d開始陰道給藥, 每次給藥5 mL, 連續給藥7 d。

1.5陰道灌流液收集

在首次給藥前, 以及末次給藥后24 h和72 h分別采集陰道灌流（CVL）液。用20 mL無菌PBS（pH 7.2）對各處理組小型豬進行陰道灌洗，收集CVL液。

1.6流式細胞儀檢測CVL液中的炎性細胞［5］

CVL液經200目的細胞篩過濾去除雜質后，置離心管中，常溫1 000×g，5 min離心收集細胞，用含1%慶大霉素的PBS重懸， 體積分數1%多聚甲醛1∶1固定，熒光分選細胞儀檢測，應用CellQuest多功能分析軟件收集，并計數10 000個細胞。根據向前散射光（FSC）為橫坐標，側向散射光（SSC）為縱坐標，設門分選出淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞和陰道上皮細胞四個獨立細胞群的二維散點圖。用FlowJo軟件分別標出每個細胞群占檢測細胞總數的百分比。

1.7小型豬陰道取材及病理檢查和評分

末次給藥72 h后處死小型豬，解剖摘取完整陰道組織，縱向切開，肉眼觀察是否充血、水腫等異常表現，然后用體積分數10%中性緩沖甲醛固定制成石蠟切片，HE染色，組織病理學檢查。按照D'Cruz提出陰道刺激性試驗方法和標準［6］，選擇若干更易判斷的病理終點（包括： 潰瘍/壞死、白細胞浸潤、充血、出血、水腫、空泡化等）反映陰道黏膜上皮、固有層及其血管和周圍組織的病理變化，采用5個等級表示刺激的嚴重程度，評分標準：無變化=0；輕微=1；溫和=2；中等=3；嚴重=4，從而記錄藥物對小型豬陰道黏膜的刺激性。各項病變以0～4分記錄，總分為32分。

1.8統計學分析

2　結果

2.1CVL炎性細胞分析

FACS caliber型流式細胞儀檢測3次CVL液包括中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞和陰道上皮細胞的變化。由圖1可知, 給藥前各組小型豬CVL液炎性細胞極少（圖1A、D、G）, 組間差異不明顯。在末次給藥后24 h和72 h, 空白膠組炎性細胞和中性粒細胞無明顯變化（圖1B、C）, 而dl-扁桃酸凝膠組和N-9 凝膠組中性粒細胞均有升高，但dl-扁桃酸凝膠組的增幅顯著低于N-9 凝膠組，末次給藥后24 h, dl-扁桃酸凝膠組約為18%, N-9 凝膠超過40%（圖1E、H）, 末次給藥后72 h, dl-扁桃酸凝膠組約為19%, 無明顯上升, 而N-9 凝膠接近50%, 有顯著上升（圖1F、I）。結果表明連續給藥7 d后已有中性粒細胞由陰道進入CVL液中, 但N-9 凝膠組中的中性粒細胞顯著高于dl-扁桃酸凝膠組。不同時間各處理組小型豬CVL液的炎性細胞數, dl-扁桃酸凝膠組與空白膠組相比, 有增加趨勢, 但仍顯著低于N-9 凝膠組。上述結果說明, dl-扁桃酸凝膠雖能引起小型豬CVL液的炎性細胞、特別是中性粒細胞的輕微的升高，但仍明顯低于市售的N-9凝膠。

2.2豬陰道組織病理學分析

表 1　各組小型豬不同時間CVL的中性粒細胞百分率　%

根據向前散射光（FSC）為橫坐標，側向散射光（SSC）為縱坐標，設門分選出淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞和陰道上皮細胞四個獨立細胞群的二維散點圖。這是來自處理組其中之一的典型圖譜，每個樣本分析10 000個細胞，用FlowJo軟件分別標出每個細胞群占檢測細胞總數的百分比（%）。A： 空白膠給藥前； B： 空白膠末次給藥后24 h； C： 空白膠末次給藥后72 h； D： dl-扁桃酸凝膠給藥前； E： dl-扁桃酸凝膠末次給藥后24 h； F： dl-扁桃酸凝膠末次給藥后72 h； G： N-9 凝膠給藥前； H： N-9 凝膠末次給藥后24 h； I： N-9 凝膠末次給藥后72 h

表 2　各組小型豬不同時間CVL的炎性細胞百分率　%

空白膠組黏膜上皮結構完整，固有層無明顯空泡和水腫，損傷不明顯（圖2A、B、C）。dl-扁桃酸凝膠組黏膜上皮基本結構完整，黏膜固有層毛細血管充血明顯，但炎癥細胞無明顯增多（圖2D、E、F）。4%N-9凝膠組黏膜上皮結構損傷明顯，出現空泡、水腫，并出現局部脫落，伴炎癥浸潤，黏膜固有層充血明顯，血管周圍炎癥細胞明顯增多，局部炎癥細胞浸潤明顯（圖2G、H、I）。而在表3小型豬陰道刺激評分中，空白膠組各項評分處于最低，其總分也最低, 為3.3±1.6, 而N-9 凝膠組各項評分最高，總分20.5±3.5，dl-扁桃酸凝膠組總分5.1±0.5，稍高于空白膠組，但低于N-9 凝膠組，說明在給藥后，空白膠組陰道受刺激最輕，對陰道黏膜基本無損傷，而N-9 凝膠組刺激最為嚴重，對陰道黏膜損傷較為嚴重，dl-扁桃酸凝膠雖對陰道黏膜有一定的刺激，但其刺激作用顯著低于N-9 凝膠。

3　討論

近年來外用避孕藥物研發迅速，其中主要一類藥物為以N-9為代表的表面活性劑，雖具有較強的殺精子作用，但是作為一種表面活性劑，在殺精子的同時，也對陰道黏膜細胞有較強的刺激作用，長期使用將會破壞陰道黏膜上皮屏障的完整性，而且能誘發黏膜的炎癥反應，影響陰道黏膜的免疫功能［7-9］。為了尋找安全有效、對陰道黏膜刺激性小、能維護陰道正常微生態的外用避孕新藥，dl-扁桃酸的前期研究已證明其具有很好的抑精作用，但其作為外用避孕藥的安全性尚不明確。

圖2　小型豬陰道組織病理學分析（HE×200）

表 3　小型豬陰道黏膜刺激性評分

生殖道炎癥和免疫防御功能在性傳播疾病的發生發展過程中扮演者關鍵角色。炎性細胞中的中性粒細胞數量及其活化狀態是驗證陰道黏膜炎癥反應的重要參考指標，炎性細胞數的升高往往與陰道黏膜損傷、免疫炎癥反應以及性傳播疾病的感染相關［10］。研究表明N-9能引起陰道黏膜上皮的損傷和嚴重的組織炎癥反應，引起大量炎癥細胞特別是中性粒細胞等進入陰道灌流液中［11］。本研究采用流式細胞技術分析小型豬陰道灌流液中的炎性細胞數量及其活化狀態，發現相dl-扁桃酸凝膠組中陰道灌流液中的炎中性粒細胞的輕微的升高，但仍顯著低于市售的N-9凝膠。由此證明，dl-扁桃酸雖然在一定程度上能引起陰道黏膜的炎癥反應，但其嚴重程度顯著低于N-9 凝膠。

通過陰道灌流液的監測，可以了解陰道黏膜的炎癥反應，而通過組織病理技術可以直觀分析藥物對陰道黏膜刺激損傷作用［12］。本課題組按照D'Cruz等提出的陰道刺激性實驗方法來評估陰道黏膜受損狀況。在末次給藥72h后處死動物，收集陰道組織制成石蠟切片，HE染色，進行常規病理分析。在陰道黏膜上皮，黏膜固有層，血管與血管周圍，N-9凝膠組均出現較為嚴重的損傷，表現為黏膜潰瘍、細胞壞死，白細胞浸潤、出血、水腫等，而dl-扁桃酸凝膠組與空白膠組多數指標無顯著差異，但血管周圍組織充血較明顯，其程度與N-9凝膠相似。

在本研究中為了探明dl-扁桃酸作為外用避孕藥的安全性，作者采用了雌性廣西巴馬小型豬作為陰道黏膜刺激模型。dl-扁桃酸凝膠和市售N-9凝膠比較結果表明，前者對陰道黏膜的刺激作用顯著低于后者，扁桃酸具有更高的安全性。而小型豬作為陰道黏膜刺激模型，能夠客觀的反應陰道損傷情況，以及免疫細胞與細胞因子的活化狀態，因此是一種很好的動物模型。此外，dl-扁桃酸作為外用避孕新藥，其長期應用的有效性和安全性，有待更進一步的實驗研究。

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［Abctract］ObjectiveTo study the vaginal irritation of dl-Mandelic acid thermosensitive in situ Gel （dl-Mandelic acid-TISG） in miniature pigs. MethodsNine miniature pigs injected with estradiol benzoate （400 μg/kg） were randomly divided into three groups： control group, dl-Mandelic acid -TISG group and nonoxynol-9 gel （N-9 gel） group. Each miniature pig was administrated with 5 mL gel through vagina once daily for 7 days. Cervicovaginal lavage （CVL） fluids were collectedbefore administration and at the 24 h and 72 h after the last administration. The number of inflammatory cells and neutrophilic granulocytes in the CVL were detected by the flow cytometry. The miniature pigs were sacrificed at 72 h after the last administration. Histopathological changes of the vaginal mucosa were observed under light microscope. ResultsThe number of inflammatory cells and neutrophilic granulocytes in the dl-Mandelic acid-TISG group were significantly lower than that in the N-9 group （P＜0.05）. Histological scoring of vaginal mucosa showed that there were no obvious mucosal epithelium damage, vascular congestion and inflammatory cell infiltration （5.10±0.47） in the dl-Mandelic acid-TISG group.There was no significant difference （3.30±1.60, P＞0.05） compared with the control group （P＞0.05） but significant difference compared with the N-9 group （20.50±3.50, P＜0.05）. ConclusionThe vaginal irritation of dl-Mandelic acid-TISG in miniature pigs is mild.

Study on Vaginal Irritation of dl-Mandelic Acid Thermosensitive in situ Gel in Miniature Pig

XIA Min- jie1, HUANG Chao1, TIAN Fang1, WANG Yu- zhu1, ZHI Rui- na1,2, DING Xun-cheng1, Yan Qian-Qin3, LI Wei- hua1
（1. State Key Labs of Family Planning Devices， Shanghai Institute of Planned Parenthood Research，Shanghai， 200032， China； 2. School of public health， Fudan University， Shanghai 200032， China；3.The Sixth People's Hospital， Shanghai 200233， China）

dl-Mandelic acid-TISG； Miniature pig； Inflammatory cells； Neutrophilic granulocytes

Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0356-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.003

2015-01-27

國家科技重大專項（2012ZX10001007-009-003, 2013ZX10001006-003-002）； 十二五國家科技支撐計劃（2012BAI31B04）； 國家自然科學基金青年基金項目 （81100459）； 上海市科委項目（13431900800）；上海市人口和計劃生育委員會（2012JG03）。

夏敏杰（1983-）, 男, 碩士, 研究實習員, 遺傳學。E-mail： mito1983@163.com。

李衛華, 女, 博士, 研究員。E-mail： iamliwehua@yahoo.com。嚴錢勤, 女, 本科, 主管技師。E-mail： yanqianqin3@sina.com