兩種大鼠骺板損傷模型的比較

景金珠, 李清海, 呂學敏, 梁　震, 王　猛

（1. 北京積水潭醫院 北京市創傷骨科研究所, 北京　100035；

2. 山東泰安軍分區第一干休所, 泰安　271000；

3. 北京積水潭醫院小兒骨科, 北京　100035）

兩種大鼠骺板損傷模型的比較

景金珠1, 李清海2, 呂學敏3, 梁震1, 王猛1

（1. 北京積水潭醫院 北京市創傷骨科研究所, 北京100035；

2. 山東泰安軍分區第一干休所, 泰安271000；

3. 北京積水潭醫院小兒骨科, 北京100035）

目的比較直接刮除法和手動成角法制備的骺板損傷模型的差別，為更好地研究骺板損傷的病變進程、治療和預后提供實驗基礎。方法4～5周齡Wistar大鼠45只，分為3組, 第1組為對照組，不作處理，正常飼養； 第2組為直接刮除組，直接切除脛骨上端前內側骺板制作骺板損傷模型； 第3組為手動成角組，采用外翻用力，并適當加用剪切力使骨骺在骺板軟骨水平與干骺端分離制作骺板損傷模型。均于術后4 d、10 d和21 d處死，取雙側脛骨。行Micro-CT掃描，用系統分析軟件CTAn（comprehensive TeX archive network）測量各時間點雙側脛骨長度、脛骨粗隆寬度以及脛腓骨之間最寬距離的差值，并進行統計學分析。組織學切片HE染色，觀察損傷骺板在各時間點的形態學特征。結果直接刮除法與手動成角法Micro-CT、HE染色檢測顯示，二者在術后4 d均見到骺板寬度增加，前者出現周圍骨質密度減低和幼稚軟骨細胞； 術后10 d，前者出現骺板變窄，后者開始出現周圍骨質密度減低；術后21 d，前者有明確的骨橋形成，骺早閉出現，后者僅見細小新生骨質。標本大體測量結果顯示，術后各時間點兩種方法脛骨長度差值、脛骨粗隆寬度差值以及脛腓骨之間最寬距離的差值均顯著高于對照組（P＜0.05）； 術后21 d，直接刮除組數據均大于手動成角組（P＜0.05）； 術后4 d和10 d，兩種方法沒有顯著性差異（P＞0.05）。結論直接刮除法制作的大鼠骺板損傷模型，具有相對明確的均一性和穩定的造模成功率，更適合于對骺板損傷的機制探討等基礎性研究。

動物模型； Micro-CT； 骺板損傷

兒童的骺軟骨和骺板軟骨遠比骨骺和韌帶脆弱, 因此骺板損傷在兒童骨關節創傷中最為常見, 據統計, 兒童時期的長管狀骨骨折, 約15%～18%累及骺板, 而因骺板損傷導致明顯畸形者約占10%［1］。骺板損傷導致骨骺與干骺端之間形成骨橋，使骺板全部或部分提前閉合，造成肢體短縮和（或）成角畸形［2］，影響兒童生長發育，而且其治療非常困難，目前尚無特異的治療手段。因此，骺板損傷一直是小兒骨科界研究的熱點問題，近年來不少學者致力于小兒骺板損傷的診斷和治療，在組織學、影像學、生物力學、分子生物學等方面取得了一定進展［3,4］，各種動物實驗和臨床治療方法的報道也較為常見。骺板損傷按Salter-harris 分型法，分為五型［5］，其中Ⅱ型（剪式和推壓的合力，使骺板裂開，同時引起干骺端骨折）最為多見。作者采用直接刮除法和手動成角法構建大鼠脛骨近端II型骺板損傷模型，并于術后不同時間點取材，進行組織學觀察、Micro-CT掃描并測量大體數據，動態觀察和比較兩種方法制備骺板損傷模型的差異，為更好的研究骺板損傷的病變進程以及治療和預后提供實驗基礎。

1　材料與方法

1.1實驗動物

清潔級4～5周齡Wistar大鼠46只（1只麻醉意外死亡），雌雄不限，體質量150±10 g，購于維通利華實驗動物中心［SCXK（京）2011-011］。

動物實驗場地： 北京積水潭醫院屏障動物室［SYXK（京）2012-0027］。

1.2儀器、試劑

Micro-CT（Skyscan1172, 產地比利時）, RM-2235組織切片機購自德國Leica公司。甲醛、蘇木素、伊紅等組織切片和染色用試劑購自北京賽馳生物科技有限公司，國產分析純乙醚。

1.3方法

1.3.1大鼠骺板損傷模型建立將大鼠分為3組, 第1組為對照組，不作處理，正常飼養； 第2組為直接刮除組，直接切除法制作骺板損傷模型； 第3組為手動成角組，采用手動損傷的方法制作骺板損傷模型。直接刮除組： 大鼠行乙醚麻醉，仰臥固定于手術臺上，右側膝關節脛骨上端前內側逐層縱向切開，用無菌紗布清理傷口，切除脛骨上端前內側骺板，損傷面為總面積的25%～30%，建立骺板損傷模型，生理鹽水沖洗后逐層縫合骨膜及皮膚軟組織。手動成角組： 麻醉固定方法同“直接刮除法”，右側膝關節脛骨上端行橫向切口，分離開內側副韌帶和軟骨膜，捏持膝關節及脛骨，施加外翻應力，使骨骺在骺板軟骨水平與干骺端分離呈20～30度角。直視下明確骺板損傷，復位，生理鹽水沖洗后逐層縫合骨膜及皮膚軟組織。建立脛骨近端Ⅱ型骨骺損傷改良模型。

動物分別于術后4 d、10 d、21 d處死，完整解剖雙側脛骨，行Micro-CT掃描，CTAn （Comprehensive TeX Archive Network）測量大體數據，之后以體積分數10%的甲醛溶液固定，行組織形態學觀察。

1.3.2骺板形態的Micro-CT觀察雙側脛骨去除附著結締組織, 將樣本固定在Micro-CT系統的檢測樣本臺上, 設置掃描數據，進行粗掃描，然后設置參數，掃描獲取圖象，掃描完成，調節系統進行2D 及3D的圖形重建。得到脛骨近端冠狀位圖像（此位置圖像顯示最佳）和3D圖像。觀察比較掃描結果。

1.3.3標本的大體測量以Micro-CT系統自帶的分析軟件CTAn測得雙側脛骨長度、脛骨粗隆寬度、脛腓骨之間最寬距離數值，做雙側差值，對樣本分析處理采集數據。

1.3.4標本的組織學觀察Micro-CT掃描后樣本置于體積分數10%甲醛中固定。30% 甲酸脫鈣，石蠟包埋，制備成 4 μm 切片后進行HE染色，進行組織學評價。

1.4統計學方法

2　結果

2.1Micro-CT掃描

模型構建4 d，與對照組相比，直接刮除法與手動成角法均可見骺板寬度增加，密度欠均勻，骨骺面及干骺面毛糙，呈輕度波浪狀改變，前者還可觀察到內側干骺端處骨質缺損，呈干骺端骨折改變，周圍骨質密度減低（圖1）。

模型構建10 d，與對照組相比，直接刮除法可見骺板寬度變窄，干骺端骨折處周圍骨小梁稀疏，呈骨質疏松改變，有少許骨連接，可能為骨橋。手動成角法可見骺板邊界粗糙，骺板寬度增寬，周圍骨質密度明顯減低（圖1）。

模型構建21 d，與對照組相比，直接刮除法可見干骺端骨折處出現顯著改變，即骨橋形成，可見骨小梁由干骺端深入骨骺，骺早閉出現。手動成角法可見骺板變窄，內見細小新生骨質成份，干骺端可見迂曲透亮影, 骨膜反應較前減弱（圖1）。

2.2組織學觀察

模型構建4 d，與對照組相比，直接刮除法可見骺板增寬，內側骺板成分缺失，成熟軟骨細胞體積增大，兼伴有散在基質成分，干骺端骨折區初級骨小梁消失。手動成角法可見骺板成分缺失，大量散在紅細胞兼伴有散在基質成分（圖2）。

模型構建10 d, 與對照組相比, 直接刮除法骺板損傷區內可見幼稚軟骨細胞, 干骺端骨小梁稀疏, 基質增加。手動成角法可見組織細胞肥大、變性, 骺板軟骨細胞部分排列紊亂失去柱狀結構（圖2）。

模型構建21 d，與對照組相比，直接刮除法可見骺板損傷區可見骨性結構，骨小梁由干骺端深入骨骺，骨橋形成，提示骺早閉。手動成角法部分區域可見幼稚軟骨細胞，干骺端骨小梁稀疏，基質增加，部分有骨橋形成（圖2）。

A： 對照組； B： 直接刮除組； C： 手動成角組圖1　動物模型Micro-CT掃描表現A： Control group； B： Direct-injury group；C： Manual-rotation groupFigrue 1　Micro-CT scans to assess changes in epiphyseal plate

2.3各時間點脛骨大體測量

測量結果詳見表1～3。

表 1　各時間點大鼠脛骨長度差值比較Table 1　Comparasion of the length of tibia among　different groups in rats　　　　　　　　　　　　　　　　　mm

表 2　各時間點大鼠脛骨粗隆寬度差值比較Table 2　Comparasion of the width of tibial tuberosity among different groups in rats　　　　　　　　　　　　mm

表 3　各時間點大鼠脛腓骨之間最寬距離差值比較Table 3　Comparation of the maximal interval between tibia and fibula among different groups in rats　　mm

3　討論

按照Kaul等［6］的提議，在一種動物模型中，至少要求具有三種特征，即： 便利、相似、合適。便利指的是容易得到，這是一個選擇動物模型的主要標準；相似是指涉及在動物中所研究的現象應與人類的有可比性； 合適則要求其它因素的綜合應使某一樣本最適合研究某一特殊現象。

目前骺板損傷應用的模型動物有小鼠、大鼠、兔、豬、犬、牛、羊等。其中最常用來制備骺板損傷模型的動物是4～5周齡的大鼠［7-11］和5～6周齡的新西蘭兔［12,13］, 同時對它們幼年的骺板特點和骨骺融合時間的研究較為詳盡。本實驗將這兩種方法應用于大鼠, 大鼠的骺板與人類近似, 且其生命周期短, 可以較快的提供研究結果。但是模型建成后的影像檢查無論是X線、CT, 還是MRI檢查就遇到了瓶頸, 檢查部位體積較小會導致影像質量較差, 或者沒有相對小的線圈無法進行MRI檢查。Micro-CT的高分辨率正好解決了這個問題［14,15］, 其系統自帶的CTAn分析軟件可以精確的測量各種數據。并且聯合HE染色對不同模型制備方法進行比較。

在本實驗中直接刮除法損傷骺板累及生長板軟骨全層，尤其是骺板靜止細胞層和增殖層，易在骨骺與干骺端之間形成纖維血管橋甚至骨橋，導致骺板的早閉 。Micro-CT和HE染色均顯示能夠良好復制骺板損傷的病變，成功率高，大體測量的數據方面顯示出現骨短縮、成角等畸形的狀態較為均一。術后4 d和10 d，兩種方法沒有顯著性差異（P＞0.05）； 術后21 d，直接刮除組數據均大于手動成角組（P＜0.05）。直接法制備骺板損傷模型為骺板軟骨全層損傷, 缺損較明顯，此動物模型雖然與臨床上常見的骺板損傷類型不十分吻合，但具有對比研究骺板損傷后變化的價值。而采用手動法制備模型, Micro-CT和HE染色均顯示骺板損傷的發展滯后于直接刮除法，改變不及前者明顯, 這與骺板血運屏障是否被破壞有關。不同術者在不同時間, 甚至同一術者在不同時間在力量和方向控制上均會有不同程度的差異。因此, 盡管手動成角法與臨床損傷時所受的外力復雜情況相近，但缺乏動物實驗模型的均一性，很難在實驗過程中達到標準的統一。

綜上所述，在大鼠骺板損傷模型的構建上，盡管直接刮除法操作較為復雜，但具有相對明確的均一性和穩定的造模成功率。因此該方法更利于對骺板損傷的機制探討等基礎性研究。

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Comparison on Two Models of Epiphyseal Plate Injury in Rat

JING Jin-zhu1, LI Qing-hai2, LV Xue-min3, LIANG Zhen1, WANG Meng1
（1. Beijing Jishuitan Hospital， Beijing Institute of Traumatology and Orthopaedics， Beijing 100035， China；
2. Tai'an No.1 military subarea sanatorium， Shandong Province， Tai'an 271000， China；
3. Department of Pediatric Orthopedic， Beijing Jishuitan Hospital， 100035 Beijing， China）

ObjectiveTo compare two methods for constructing animal models of epiphyseal plate injury, and therefore to learn more about the disease of epiphyseal plate injury. MethodsFourty-five Wistar rats aged between 4-5 weeks were divided into three groups. Group A was control group, without operation； Group B was direct-injury group, in which the upper part of right tibial epihpyseal plate were cut； Group C was manual-rotation group, in which the knees of rats were grabbed valgusly. The rats were sacrificed after 4, 10 and 21days of operation. Micro-CT scanning and histological assessments were done. The differences between the length of left and right tibia, the width of tuberositas of left and right tibiae, and the minimum distance between tibia and fibula were examined by CTAn（Comprehensive TeX Archive Network） software. ResultsMicro-CT scanning and histological assessments showed that, after 4 days of operation, the width of epiphyseal plate were larger in Group B and Group C, immature chondrocytes were found in Group B, and the bone mineral density around operation site were lower than control in Group B. After 10 days of operation, the epiphyseal plate became narrower in Group B, and the bone mineral density around operation site appeared to be lower than normal in Group C. After 21 days of operation, the bone bridge was found in Group B, and only small new-born sclerotin appeared in Group C. According to the length of tibia, the width of tibial tuberosity, and the maximal interval between tibia and fibula, all of these values in Group B and Group C were significantly higher than Group A （control group） （P＜0.05）； but the values after operation of 21 days of Group B were significantly higher than those of Group B （P＜0.05）, other values were not significantly different between the two groups （P＞0.05）. ConclusionIt is proved that the method of direct-injury is a much better one for constructing rat models of epiphyseal plate injury. This method has good stability and variation which more proper for studying disease of epiphyseal plate injury.

Animal model； Micro-CT； Epiphyseal plate injury

Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0351-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.002

2015-01-22

國家自然科學基金資助課題（30750011）

景金珠（1977-）, 女, 碩士, 主管技師, 主要從事實驗動物醫學與動物實驗教學工作。E-mail： yaoyyy@sohu.com

呂學敏。E-mail： 914278530@qq.com