應用活體生物發光成像技術研究納米雄黃的抗小鼠惡性黑色素瘤肝肺轉移作用

席曉霞, 席棟賓, 范臨蘭, 魏虎來

（1. 蘭州大學基礎醫學院醫學實驗中心, 甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室,蘭州　730000； 2. 酒泉市人民醫院, 酒泉　735000）

·論著·

應用活體生物發光成像技術研究納米雄黃的抗小鼠惡性黑色素瘤肝肺轉移作用

席曉霞1, 席棟賓2, 范臨蘭1, 魏虎來1

（1. 蘭州大學基礎醫學院醫學實驗中心, 甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室,蘭州730000； 2. 酒泉市人民醫院, 酒泉735000）

目的采用小動物活體成像技術研究納米雄黃對小鼠B16-luc惡性黑色素瘤的抗轉移作用和機制。方法以螢火蟲熒光素酶（luciferase, luc）基因標志小鼠B16黑色素瘤細胞（B16-luc）, BALB/c小鼠的尾靜脈注射B16-luc細胞制作小鼠黑色素瘤肺轉移瘤模型, 每日4 mg/kg和8 mg/kg納米雄黃灌胃24 d, 陽性對照組隔日腹腔注射順鉑（DDP） 2 mg/kg，陰性對照組灌胃生理鹽水0.02 L/kg。小動物活體成像系統動態觀察腫瘤細胞轉移情況。治療末期處死動物，取出肺和肝，置活體成像系統下直接成像，并肉眼觀察肺和肝表面轉移瘤結節形成； 另對肺、肝腫瘤組織作HE染色，光鏡下觀察組織形態變化。 結果活體成像顯示納米雄黃可顯著抑制小鼠黑色素瘤細胞在肺和肝中的轉移（P＜0.05），解剖肉眼可見肝、肺表面轉移灶顯著減少或消失，病理學檢查顯示納米雄黃治療組小鼠的肺臟內轉移瘤結節小、數量較少，大多數瘤結節中央呈壞死液化改變，肝臟內未見到轉移瘤結節。結論納米雄黃可有效抑制小鼠惡性黑色素瘤B16-luc細胞的肺轉移和肝轉移能力。

納米雄黃； 小鼠惡性黑色素瘤； 活體成像技術

雄黃的主要抗腫瘤成分為As2S2或As4S4（arsenic disulfide or arsenic tetrasulfide），自身難溶于水，臨床上常采用口服給藥易增加胃腸道刺激。雄黃被制備成納米級顆粒，可降低其粒徑, 增加溶解度、減少用藥量和提高生物利用度。近年來，納米雄黃在白血病和部分實體腫瘤的臨床治療中取得了良好的療效［1-3］。已有研究也證實納米級雄黃微粒具有明顯的抗肝癌和抗肺癌作用［4］, 并可通過調控細胞凋亡過程的關鍵基因而誘導耐藥性白血病細胞凋亡, 特別是對腫瘤干細胞（cancer stem cells, CSC）和白血病干細胞（leukemia stem cells, LSC）也具有良好的增殖抑制作用［5］。鑒于小鼠B16惡性黑色素瘤的增殖、生長、轉移特性等與人惡性黑色素瘤類似, 故成為研究惡性黑色素瘤的理想動物模型, 并已在藥物篩選、惡性黑色素瘤發生、發展、轉移的研究中得到了廣泛應用［6,7］。目前惡性黑色素瘤有效藥物及治療方案的選擇仍然是面臨的棘手問題。本研究通過BALB/c雄性小鼠的尾靜脈注射接種熒光素酶標記的B16黑色素瘤細胞（B16-luc）, 以制備小鼠肺轉移瘤模型，利用小動物活體光學成像技術比較雄黃納米微粒的抗惡性黑色素瘤轉移效應。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SPF級雄性BALB/c小鼠24只，8周齡，體質量20～22 g，由蘭州大學醫學實驗中心提供 ［SCXK（甘）2013-0002］。實驗操作及動物飼養在蘭州大學醫學實驗中心SPF級動物實驗設施進行［SYXK（甘）2013-0003］。動物實驗倫理和福利嚴格遵循科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的原則。

1.1.2儀器、試劑小動物活體成像系統（IVIS LuminaⅡ型，美國PerkinElmer公司）； 動物氣體麻醉機（美國Matrx公司）； 異氟烷（中國河北九派有限公司）； D-luc（美國冷泉港生物科技股份有限公司）； 順鉑（DDP, 齊魯制藥有限公司）； 新生小牛血清（中國蘭州榮曄生物科技有限公司）； RPMI 1640（BRL美國Gibco公司產品）。

雄黃原藥粉由西安中藥集團公司提供，采用高能球磨法制備成納米級微粒［5］。用KCl飽和的硝酸溶液滴加至完全溶解，用NaOH調節pH至7.2左右，PBS定溶，配制成2 mg/mL的儲存液，過濾除菌，4℃保存備用。

1.1.3小鼠惡性黑色素瘤細胞生物素酶標記B16小鼠惡性黑色素瘤細胞（B16-luc），為B16細胞經慢病毒載體轉染螢火蟲熒光素酶基因（firefly luciferase gene，luc）而成，可穩定表達生物素酶。由美國冷泉港生物科技股份有限公司提供。

1.2方法

1.2.1B16-luc細胞培養B16-luc細胞接種于含體積分數12%的新生牛血清、2 mmol/L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640完全培養基中, 置37℃、5% CO2培養箱飽和濕度條件（MCO-15AC型CO2培養箱，日本三洋公司）下培養。體積分數0.25%胰蛋白酶消化、傳代、取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2小鼠惡性黑色素瘤肝肺轉移模型制備及活體生物發光觀察將對數生長期的 B16-luc 細胞消化制備成單細胞懸液，無菌生理鹽水調整細胞濃度為2×106/mL。將24只BALB/c小鼠隨機分為4組, 每組6只, 每只BALB/c小鼠尾靜脈接種 0.1 mL單細胞懸液（2×105個細胞），以制作小鼠黑色素瘤肺轉移瘤模型。次日（1 d）起實驗組每日分別按4 mg/kg（低劑量組）和8 mg/kg（高劑量組）灌胃納米雄黃進行治療, 陽性對照組隔日腹腔注射DDP 2 mg/kg，陰性對照組灌胃生理鹽水0.02 L/kg。并于0 d、6 d、12 d、18 d、24 d分別用小動物活體成像系統動態觀測小鼠體內腫瘤生長及轉移情況。觀測前每只小鼠腹腔注射0.15 g/L的D-luc，10 min之后將小鼠置入動物氣體麻醉機的麻醉盒，用異氟烷進行誘導麻醉，然后置活體成像系統曝光成像，用Lumina ⅡLiving Image 4.0 軟件采集并分析光子數值。分別按下式計算抑制轉移率（IR）： IR（%）=（1-實驗組腫瘤光子數/陰性對照組腫瘤光子數）×100%。

1.2.3小鼠黑色素瘤肝、肺轉移瘤的形態學和病理觀察納米雄黃末次治療后，腹腔注射D-luc，脫臼處死小鼠，快速取出肺臟和肝臟，并肉眼觀察肺臟和肝臟表面轉移瘤結節形成。用PBS清洗臟器表面血跡，放入預先清洗消毒的平皿，分別置于活體成像系統下曝光成像，并采集照片。然后將新鮮肺臟、肝臟腫瘤組織用福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肺臟和肝臟組織形態的變化。

1.2.4統計學處理

應用 SPSS13.0 軟件對數據進行統計分析，實驗數據以均數±標準差（± s）表示，組間分析比較采用t檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1納米雄黃抑制小鼠B16-luc黑色素瘤的肺轉移和肝轉移

在小鼠肺部成功形成B16-luc黑色素瘤肺轉移瘤，隨著時間的延長肺部生物發光強度逐漸增強（P＜0.05）, 并在肝臟部位亦出現轉移細胞發光（圖1）。高劑量和低劑量納米雄黃及DDP治療后均明顯抑制小鼠B16-luc細胞在肺部的轉移生長，且抑制作用隨著用藥時間的延長而增大，發光強度較陰性對照組小鼠減低； 在各時間點，納米雄黃高劑量組的轉移抑制率均比低劑量組和陽性對照高（P＜0.05, 圖1, 圖2）。與肺轉移瘤結節計數法所獲轉移抑制率相一致（圖3B）。納米雄黃治療后肝部均未現生物發光。

2.2小鼠B16-luc黑色素瘤肝肺轉移瘤的病理改變

對照組肺臟體積較大、其表面有大量的黑色腫瘤轉移灶； 肝臟體積也較大、表面亦有少量轉移瘤結節。經納米雄黃治療后, 小鼠的肺臟體積縮小、表面轉移灶顯著減少, 以高劑量治療者最為顯著； 肝臟表面肉眼不可見明顯的轉移腫瘤結節。肺臟和肝臟轉移瘤的肉眼觀察結果與活體生物發光成像和器官生物發光成像結果相吻合（圖1, 圖3）。肺臟和肝臟病理切片觀察可見, 對照小鼠肺臟內有多量的轉移瘤結節灶, 肝臟內有少量的轉移瘤結節灶, 結節灶細胞內可見大量黑色素沉著。部分腫瘤轉移灶中央區可見少量壞死改變； 納米級雄黃治療小鼠的肺臟內轉移腫瘤結節灶數量明顯減少, 體積較小, 大多數瘤結節中央區域呈液化壞死樣改變。肝臟內未見到轉移瘤結節灶（圖4）。上述結果證實納米雄黃可有效抑制黑色素瘤細胞經血道導致的肺臟、肝臟轉移。

圖2　納米雄黃治療對小鼠B16-luc細胞肝肺轉移的抑制作用Figure 2　The anti-metastasis effects of realgar nanoparticle treatment on the hepatic and pulmonary metastasis of B16-luc cells in mice

3　討論

B16-luc小鼠黑色素瘤由美國Jackson 實驗室建立，可在體外傳代培養和制備實驗動物移植性腫瘤，并已篩選出了多種轉移性強的B16-luc細胞亞系，廣泛地用于腫瘤發生、轉移過程和影響腫瘤發展、轉移等研究領域, 具有較大的應用價值［7,8］。

惡性黑色素瘤是常見的皮膚腫瘤，惡性程度極高，占皮膚腫瘤死亡病例的大部分。惡性腫瘤最顯著的生物學特征是侵襲和轉移，而腫瘤的侵襲和轉移主要依賴新生血管的形成。因此，能否阻止侵襲和轉移是惡性腫瘤治療成敗的關鍵因素。本研究采用尾靜脈接種B16-luc細胞建立BALB/c小鼠惡性黑色素瘤肝肺轉移瘤模型，納米雄黃治療可顯著抑制小鼠肺和肝中黑色素瘤轉移灶的形成，且多數轉移結節中心區域出現壞死液化現象，證實納米雄黃可有效抑制小鼠黑色素瘤的肺和肝轉移。李秀榮等［9］研究表明納米雄黃可通過上調色素上皮細胞衍生因子（PEDF）基因和下調血管內皮細胞生長因子（VEGF）基因的表達抑制人皮膚鱗癌A431新生血管生成。本文作者［10,17］前期研究也證實納米雄黃顯著抑制小鼠乳腺癌和惡性黑色素瘤腫瘤新生血管的形成。據此，作者推測納米雄黃可能通過抑制腫瘤新生血管生成進而阻斷腫瘤細胞的遷移和營養通道而發揮抗轉移的作用。有關納米雄黃抗腫瘤轉移的確切細胞分子機制有待進一步深入研究。

圖3　納米雄黃抗小鼠B16-luc黑色素瘤肝肺轉移瘤原位肉眼觀察和生物發光成像的比較Figure 3　The in situ comparision of anti-metastasis effects of realgar nanoparticle in liver and lung of B16-luc bearing mice by visual observation and bioluminescence imaging

圖4　納米雄黃治療后小鼠B16-luc黑色素瘤肝肺轉移瘤組織的病理變化（HE ×20）Figure 4　Pathological observation on hepatic and pulmonary metstsis tumors in B16-luc melanoma-bearing mice treated with realgar nanoparticles （HE×20）

光學活體成像技術（optical in vivo imaging）是利用熒光（fluorescence）或生物發光（bioluminescence）成像原理直接監測動物活體內細胞的生物學行為或特定分子事件，能夠在肉眼尚不能觀察到腫瘤的時候即可觀察、量化活體內腫瘤的生長和轉移情況，具有動態、簡便、直觀、精確、定量、特異性和靈敏度高等特點。該技術既能避免常規動物實驗中大量處死實驗動物，又可動態跟蹤同一目標隨時間的變化趨勢，避免因傳統實驗方法和個體差異對實驗結果的干擾。與傳統的腫瘤轉移瘤結節計數法相比，生物發光法更靈敏，更準確；避免了因腫瘤轉移瘤結節融合，腫瘤組織內壞死組織和細胞的干擾而導致的主觀因素的影響，能更客觀的反應藥物對腫瘤的抑制作用。因此，活體成像技術已成為廣泛應用于生物醫學、動物醫學及藥物開發研究領域的前沿技術［11-19］。與傳統動物實驗技術相比，本文采用的小動物光學活體成像技術研究雄黃納米微粒的抗小鼠黑色素瘤肺肝轉移作用具有顯著技術優勢，能夠在活體動物水平方便、經濟和動態評價藥物的抗轉移效應。

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Anti-metastatic Actions of Realgar Nanoparticles on Hepatic and Pulmonary Metastasis of Murine Malignant Melanoma with in vivo Bioluminescence Imaging System

XI Xiao-xia1, XI Dong-bin2, FAN Lin-lan1, WEI Hu-lai1
（1. Laboratory Center for Medical Sciences， Key Laboratory of Preclinical Study for New Drugs of Gansu Province， School of Basic Medical Sciences， Lanzhou University， Gansu Lanzhou 730000， China；2. The People's Hospital of Jiuquan City， Jiuquan 735000， China）

ObjectiveTo study the anti-metastasis action and mechanisms of realgar nanoparticles （nano-realgar） on malignant melanoma B16-luc cells in mice by application of in vivo bioluminescence imaging assay. MethodsThe firefly luciferase （luc） gene was transferred into murine B16 melanoma cells with a lentiviral vector（B16-luc cells）. B16-luc cells were injected into tail vein of BALB/c mice to establish the pulmonary and hepatic melanoma metastasis model. The model mice were treated with 4 mg/kg and 8 mg/kg nano-realgar once a day by ig for 24 days, and the optical in vivo imaging system was used continuously and dynamically to observe the tumor metastatic situation in mice. At the end of the treating period the mice were sacrificed, and the lungs and liver were removed, and the fluorescence images of the organs were acquired directly with the optical in vivo imaging system, and the metastasis nodules on the lung and liver surface were also observed for perusal. Finally the lung, liver and tumor stained with HE staining, and the morphological changes were observed under microscope. ResultsObservation with optical in vivo imaging system showed that nano-realgar administration could markedly suppressed the pulmonary and hepatic metastasis of B16-luc cells （P＜0.05）. After nanorealgar treatment, the numbers of pulmonary and hepatic metastasis nodules significantly reduced even disappeared, and pathological examinations revealed that, in the nano-realgar treated mice, the metastasis nodules in lungs seems small and little, the liquefactive necrosis appeared in the central area of most nodules, and no metastasis nodules was found in liver. ConclusionRealgar nanoparticles are able to inhibit significantly the abilities of pulmonary and hepatic metastasis of B16-luc malignant melanoma cells in mice.

Realgar nanoparticle； Murine malignant melanoma； Optical in vivo imaging

R73-3 Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0345-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.001

2014-12-02

中央高校基本科研業務費專項資金自由探索面上項目 （LZUjbky-2015-157）, 甘肅省自然科學研究基金計劃項目（1208RJZA183）和甘肅省中醫藥科學技術研究課題（GZK-2010-17）

席曉霞（1979-）, 女, 博士, 實驗師, 研究方向： 醫學實驗動物學/獸醫學。E-mail： xixx@lzu.edu.cn

魏虎來, 男, 教授, 博士生導師, 研究方向： 細胞分子生物學/醫學實驗動物學。E-mail： weihulai@lzu.edu.cn