大鼠頸總動脈球囊拉傷所致血管狹窄模型的建立

楊　波， 吳　冰， 唐俊明， 楊建業， 曹　騰， 王家寧

（1. 武漢大學人民醫院心內科， 武漢 430060；2. 湖北醫藥學院附屬人民醫院臨床醫學研究所， 十堰 442000）

·論著·

大鼠頸總動脈球囊拉傷所致血管狹窄模型的建立

楊波1， 吳冰1， 唐俊明2， 楊建業2， 曹騰1， 王家寧2

（1. 武漢大學人民醫院心內科， 武漢 430060；2. 湖北醫藥學院附屬人民醫院臨床醫學研究所， 十堰 442000）

目的建立一種簡便實用的大鼠頸總動脈球囊拉傷的方法， 為研究物理損傷基礎上的血管形態、細胞、生物化學成份等的變化提供穩定可靠的動物模型。方法30只體質量450～500 g雄性SD大鼠， 異氟烷麻醉后， 分離頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈， 并在頸外動脈上做切口，然后用2F球囊導管沿切口插入頸總動脈， 插入約4 cm后， 注入0.02 mL生理鹽水使球囊膨脹，輕輕旋轉著拉出導管， 反復3次， 致使頸總動脈內膜完全剝脫， 在其損傷后1 d、3 d、7 d、14 d、28 d分別取材， 并進行病理組織學觀察。結果損傷后隨著時間的推移新生內膜明顯增生， 14 d增生達到高峰。結論改進的大鼠頸總動脈球囊拉傷模型方法簡便， 手術成功率高， 并且血栓形成率低。

頸總動脈； 血管再狹窄； 球囊拉傷； 2F球囊導管； 新生內膜增生

冠心病是嚴重危害人類健康的常見病，是發達國家及中國人群主要的死亡原因之一。經皮冠脈介入（percutaneous coronary intervention，PCI）是目前臨床上治療冠心病的有效措施之一。但 PCI術后再狹窄是影響其遠期療效的主要限制因素［1-3］。由于難以直接從再狹窄患者獲取樣本進行大樣本的臨床研究而限制了血管損傷再狹窄的臨床研究。因此，建立一個能很好反映血管損傷再狹窄臨床病理生理特點的動物模型顯得非常必要，并據此開展的研究將對PCI后血管再狹窄的防治具有重要理論及實踐意義。

大鼠頸動脈球囊損傷模型是目前國際上公認的研究血管損傷后新生內膜形成的經典模型［4-7］。但由于種種原因，其手術操作、模型成功率、大鼠存活率等需要進一步的優化改善。本研究期望在國外研究報道的基礎上［8-11］，試圖通過改進手術操作流程、血壓控制、抗凝管理以及術后護理等多個環節而建立一種操作簡便、模型成功率高、血栓發生率低、動物成活率高的大鼠頸總動脈球囊拉傷模型方法。

1　材料與方法

1.1實驗動物及主要材料

SPF級雄性SD大鼠30只， 體質量450～500 g，購于湖北醫藥學院動物實驗中心［SCXK（鄂）2011-0008］， 飼養于屏障設施［SYXK（鄂）2011-0031］。2F球囊導管（2 F Fogarty arterial embolectomy balloon catheter）購于美國Baxter Edwards Healthcare 公司；小動物麻醉機購于美國歐美達（Ohmeda）公司； 切片機購于德國萊卡（Leica）公司； 普通光學顯微鏡購于日本Nikon公司； 顯微手術器械購于美國Fine science公司。異氟烷購于山東魯南制藥公司。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠頸總動脈球囊損傷模型的建立大鼠頸總動脈球囊損傷模型的建立方法參考文獻［12］并適當改進。簡要介紹如下：大鼠行異氟烷麻醉后，固定，去除頸部的被毛， 于胸骨上端至頜下之間皮膚做一2～3 cm切口，鈍性分離肌層，暴露左側血管神經鞘，輕輕游離出一段3～5 cm長的左頸總動脈，靠近心端穿一根約5 cm長的2號縫合線以便提拉血管（圖1①～③）； 再沿左頸總動脈遠心端鈍性分離以暴露頸內動脈和頸外動脈分叉。然后在頸外動脈靠近動脈分叉的部位穿一根約5 cm長的4號縫合線打一活結備用（圖1④）， 同時， 在頸外動脈盡量靠頭部的位置穿一根長約7 cm的4號縫合線并打結（圖1⑤～⑦）。隨后再分離出頸內動脈，用長約5 cm的2號縫合線穿頸內動脈并打活結（圖1⑧）。近心端用動脈夾夾住左頸總動脈（圖1⑨）。其后，輕拉頭部方向的縫合線， 使頸外動脈與頸總動脈成一條直線， 用眼科剪在頸外動脈近遠心端上做一個垂直的切開， 深度約為該血管截面周長的1/4到1/3（圖1⑩～）。隨后， 用血管擴張器將動脈切口輕輕擴開，用鑷子輕輕夾住準備好的球囊桿部將球囊插入動脈切口（圖1）。然后， 牽拉頭部方向的縫合線，使頸外動脈與頸總動脈成直線，用鑷子夾住導管向主動脈弓方向送入，待球囊經過頸動脈分叉處后，輕拉緊縫合線環（圖1）。試取掉動脈夾，無出血后將繼續插入導管，直至導管標記位置（距離球囊端約4 cm）（圖1）。打開三通開關，經導管向球囊內注入約0.02 mL的無菌生理鹽水，關閉三通開關，使球囊保持膨脹狀態。旋轉著導管的同時，將其慢慢拉出，至動脈切口位置（圖1）。打開三通開關，回抽注射器至初始位置，使球囊恢復到未膨脹狀態。再插入導管，至導管標記位置，再次旋轉著拉出導管，至動脈切口位置。重復三次（圖1～）。最后， 打結以封閉動脈切口， 試取動脈夾，恢復血供。縫合筋膜和皮膚。手術縫合部位碘伏消毒。

圖1　大鼠頸總動脈球囊損傷模型制作流程Figure 1 The procedure of carotid artery balloon injury model in rat

1.2.2病理組織學觀察術后1 d、3 d、7 d、14 d、28 d分別取材。麻醉后，暴露并分離頸總動脈。常規心臟灌流并分離出損傷頸總動脈，置入含生理鹽水的平皿中，用眼科鑷子去除血管外膜上的其它多余組織， 然后將血管平均切成四段，每段約1 cm，分別裝入含5 mL質量分數4%多聚甲醛的小瓶。固定24 h后，經脫水透明、浸蠟包埋后，切片5 μm厚。切片經常規脫蠟水化后行HE染色。

2　結果

2.1術后動物的一般情況

手術后， 動物蘇醒快， 一般情況良好， 用高壓滅菌的食物和水飼喂大鼠， 室內溫度保持24±2 ℃。術后每日肌肉注射青霉素12萬單位預防感染，持續3 d，未見術后感染發生。此外，3只大鼠由于術中小血管破裂或者腺體受損出血等原因，術后1～3 d內出現頸部較大血腫，經切開、清創、縫合后狀態良好，后經取材及病理組織學HE染色呈現典型的血管損傷后新生內膜特征；另2只大鼠可能因術中損傷喉返神經而出現同側瞼裂變小、瞳孔變小的Horner綜合征，但在3～5 d內基本恢復正常，后經取材及病理組織學分析呈現出典型的血管損傷后新生內膜特征；僅有2只大鼠由于術中血壓下降過低致使術后損傷血管內血流慢、搏動差或不通暢等原因造成損傷血管腔內出現大量血栓，后經取材及病理組織學HE染色呈現出不典型的血管損傷后新生內膜特征。

2.2球囊拉傷后不同時間點血管組織學觀察

結果顯示： 球囊損傷血管內膜后， 中膜平滑肌層呈現出隨著時間的延長逐漸增厚的趨勢， 14 d達峰值（圖2）。這些組織學改變表明建模成功。

該圖顯示頸總動脈球囊損傷后，分別在不同時間點1 d、3 d、7 d、14 d、28 d取材，常規固定，脫水、石蠟包埋、切片。HE染色后顯示頸總動脈拉傷后新生內膜增生的動態改變的典型圖片圖2　頸總動脈球囊損傷后不同時間點大鼠新生內膜增生程度改變One day， 3 days， 7 days， 14 days， 28 days after the balloon injury of carotid artery， the carotid artery was fixed， dehydrated， embedded in paraffin and sliced. HE staining showed the typical picture of the dynamic changes of neointimal hyperplasia after carotid artery injury.Figure 2 The changes of neointimal hyperplasia after balloon injury of carotid artery at the indicted time points in rats

3　討論

目前國內外關于建立血管狹窄的報道很多［13］，主要針對嚙齒動物的建模方法有：頸總動脈結扎法［14］、股動脈線損傷法［15］和頸總動脈球囊拉傷法。頸總動脈結扎法，由于結扎頸總動脈后血流剪應力的作用使動脈內膜增生導致血管狹窄。該模型一方面并不能很好反映臨床各種類型的血管損傷如PCI術后冠狀動脈再狹窄的病理生理過程即：由于動脈內膜損傷或剝脫后中膜平滑肌層增生而形成的狹窄，因此，對研究臨床各種類型的血管損傷，尤其是PCI術后冠狀動脈再狹窄的參考價值不大。此外，由于頸總動脈結扎法引起的內膜增生不均勻， 靠近結扎部位增生明顯，而遠離結扎部位增生不典型，易造成結果評價不穩定以及評價誤判所導致的結論不嚴謹等。而股動脈線損傷模型是用直徑為0.38 mm金屬線插入股動脈，使其內膜剝脫， 進而形成內膜過度增生的血管狹窄。這也是國際公認的建立血管再狹窄模型的好方法，但是這種方法也有局限性， 由于金屬線直徑小， 有時易造成血管內膜剝脫不均勻不徹底等情況。且主要適用于小鼠，如某些基因修飾小鼠血管狹窄模型的建立。而且由于該模型必須在顯微鏡下才能更好完成操作，因此設備要求較高， 從而限制其廣泛推廣應用。

3.1模型特點及方法改進

本研究選用的大鼠頸總動脈球囊拉傷模型是國際公認的研究血管損傷后狹窄最理想的動物模型。主要優點是：操作相對簡單，球囊拉傷使血管內膜剝脫均勻徹底，術后動物狀態好，恢復快，血栓生成率及死亡率低。本模型的建立是在總結國內、外文獻報道的基礎上，通過實踐、改進而完成。主要改進如下： 1）血壓的監控： 麻醉過深往往會使血壓降低過快、血流速度減慢，引起血管損傷、血流不通暢而易致血管內血栓的形成。本研究表明通過嚴格控制術中異氟烷吸入量，避免麻醉過深，在適度的麻醉劑量下盡快完成模型整個制作手術可有效降低動物死亡率以及血栓發生率。2）本研究中建立結扎咽升動脈、枕動脈和甲狀腺上動脈的兩端，并在兩結之間剪斷，可有效避免經驗不足的手術者因過度牽拉使這些小動脈斷裂而大量出血，造成整個手術時間延長以及血栓發生率增加和動物死亡等不良反應。3）為了減少動物的痛苦，給予動物應有的福利，在縫合皮膚的同時給它們肌肉注射氯諾昔康止痛，并在雙眼涂紅霉素眼膏防治眼睛干澀。

3.2模型制備成功的注意事項

術前：關于大鼠的體質量及性別選擇問題，建議選擇450～500 g的雄性大鼠，因為成年大鼠血管腔相對較粗，便于球囊插入，拉傷效果好。不宜選擇雌性大鼠，因為雌激素對多種細胞可能有潛在的作用而影響實驗效果。但是探索利用該模型觀察雌激素及其相關因素對血管損傷再狹窄的作用，這將也是一個不錯的模型選擇。

術中：1）應在手術前準備好球囊導管， 在距離球囊端約4 cm的位置用記號筆做好標記，用1 mL注射器吸入無菌生理鹽水，充滿三通管及球囊導管，確保無氣泡產生。2）鑒于麻醉過深會使血壓過低，進而導致損傷血管易形成血栓，故應避免麻醉過深。一般在麻醉誘導階段，異氟烷與氧氣的V/V值應為3∶2。在皮膚和筋膜切開及分離血管和神經等刺激較大的過程中，異氟烷與氧氣的V/V值應為2∶2。其它過程中，異氟烷與氧氣的V/V值應為1∶2，應盡量縮短手術時間并使動物在術后最短的時間里蘇醒，控制維持血壓在合適的范圍內以降低血栓形成的幾率。由于動物個體差異，術中應適當調整麻醉參數（通過觀察頸總動脈搏動情況：搏動起伏較大有力為好）。3） 在分離動脈時，應避免損傷枕動脈，甲狀腺上動脈和咽升動脈，最好能用6號縫合線在這些小動脈兩端間結扎，并用顯微眼科剪刀從兩結之間剪斷，以避免后期牽拉大動脈時這些小動脈破裂致使大量出血。4） 動脈切口時應盡量靠近遠心端，以避免第一次切口失敗，做第二次切口有足夠的空間。5）動脈切口不宜過大，以防動脈易斷裂，致使導管無法進入。6）在球囊導管插入之前不建議浸蘸肝素溶液，雖然肝素有防止血栓形成的作用，但也可能抑制平滑肌細胞增生，從而抑制新生內膜的增生，影響實驗效果。7）向外拉導管時，應避免太過靠近動脈切口，以防球囊從動脈切口脫出，造成大量出血。

術后： 根據手術過程中失血情況，酌情經腹腔注射生理鹽水補液3～5 mL。每日肌肉注射青霉素12萬單位×3 d預防感染。

取材：1）事先準備好PBS和肝素鈉混合溶液作為灌流液，通暢灌流去除血液。2）在分離頸總動脈及修剪頸總動脈的過程中避免過度牽拉和夾閉血管，以利于保持血管固有形態。

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Establishment of Vascular Restenosis Model Induced by Carotid Artery Balloon Injury in Rats

YANG Bo1， WU Bing1， TANG Jun-ming2， YANG Jian-ye2， CAO Teng1， WANG Jia-ning2
（1. Department of Cardiology， Renmin Hospital of Wuhan University， Wuhan 430060， China；2. Institute of Clinical Medicine Renmin Hospital， Hubei University of Medicine， Shiyan 442000， China）

ObjectiveTo establish a simple and useful method of rat carotid artery balloon injury，providing stable and reliable animal model for studying the changes of vessels based on physical damage.

Common carotid artery； Vascular restenosis； Balloon withdraw injury； 2F Fogarty arterial embolectomy balloon catheter； Neointimal hyperplasia

Q95-33

A

1674-5817（2015）02-0087-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.02.001

2014-12-05

國家自然科學基金資助項目（No. 81270221）

楊波（1963-）， 博士生導師， 教授。E-mail： yybb112@whu.edu.cn；吳冰（1981-）碩士研究生。E-mail： 81532468@qq.com

王家寧（1967-）博士生導師， 教授。E-mail： rywjn@vip.163.com

MethodsRat common carotid artery， external carotid artery and internal carotid artery were isolated after anesthesia with isoflurane， the artery incision was performed in the external carotid artery， and then the 2F balloon catheter was inserted into common carotid artery in the incision， and pushed about 4 cm. Meanwhile， 0.02 mL normal saline was slightly injected to make the balloon inflate， and then the catheter was gently rotated for all the way when removing. Repeat this operation by three times to completely denude the common carotid artery intima. The changes of histomorphology in carotid artery were observed 1 day， 3 days， 7 days， 14 days， and 28 days after injury. ResultsObvious neointima hyperplasia appeared over time after damage， which reached the peak at 14 days. ConclusionThe improved rat carotid artery balloon injury model is established with the characteristics of simple operation， high success rate， and low rate of thrombosis.