應用大鼠實驗性痛經模型評價痛經停貼膏劑的鎮痛作用

劉　瑾，隋在云，侯文靜

（山東省中醫藥研究院， 濟南 250014）

應用大鼠實驗性痛經模型評價痛經停貼膏劑的鎮痛作用

劉瑾，隋在云，侯文靜

（山東省中醫藥研究院， 濟南 250014）

目的應用大鼠實驗性痛經模型評價痛經停貼膏劑的鎮痛作用，初步探討其治療痛經的作用機制。方法制備大鼠痛經模型，扭體法觀察不同劑量痛經停貼膏劑對受試動物的鎮痛作用，ELISA法測定痛經停貼膏劑對模型動物血漿6-酮-前列腺素1α（6-Keto-PGF1α）含量的影響。結果痛經停貼膏劑對實驗性痛經大鼠具有明顯鎮痛作用，可明顯減少受試動物的扭體次數，延長潛伏期， 可使痛經大鼠血漿6-keto-PGF1α含量明顯升高。結論痛經停貼膏劑對催產素所致子宮劇烈收縮的痛經大鼠有顯著的鎮痛作用， 其鎮痛機制與其對血漿6-keto-PGF1α水平的調節有關。

實驗性痛經； 痛經停貼膏劑； 扭體實驗； 6-酮-前列腺素1α（6-Keto-PGF1α）； 大鼠

痛經停貼膏劑是在臨床經驗方的基礎上結合現代工藝制成的純中藥制劑，由具有揮發性組分的當歸、吳茱萸、乳香、沒藥、肉桂、細辛、元胡、樟腦等藥物組成。經大量臨床實踐和科研病例觀察， 本品具有活血化瘀、通經活絡止痛之功效，對原發性痛經患者具有很好的臨床療效。本研究旨在通過考察痛經停貼膏劑對實驗性痛經模型大鼠的鎮痛作用，評估其抗痛經作用，并初步探討其治療痛經的作用機制，為其臨床應用提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1動物分組與大鼠類痛經模型制備

SPF級雌性Wistar大鼠，未孕，體質量180～220 g，由山東大學實驗動物中心提供［SCXK（魯）2009-0001］，實驗前用寵物電推剪將大鼠腹部神闕穴處皮膚脫毛，面積約為4 cm2，將大鼠按體質量隨機分成空白對照組、模型對照組、痛經停貼膏劑高、中、低劑量組，共5組，每組10只。參考文獻［1］方法制備大鼠類痛經模型： 除空白對照組外，其余各組大鼠連續灌服戊酸雌二醇片（補佳樂，拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司分裝， 批號： 065A）10 d（第1日、第10日每日灌胃給藥2.5 mg/kg其余8日均1 mg/kg）。

1.2給藥方法

從灌服給予戊酸雌二醇片第7日起， 痛經停貼膏劑高劑量（0.566 g生藥/cm2）、中劑量（0.283 g生藥/cm2）、低劑量（0.141 g生藥/cm2）組分別將藥物涂抹在敷料布上，然后貼在大鼠腹部神闕穴處（神闕穴定位： 根據類比原理， 在大鼠胸腹正中線胸骨柄上緣至外生殖器連線上3/4與下1/4交界點取之［2］），用白膠布固定。空白對照組和模型對照組給予空白基質貼敷，每日1次，連續給藥6 d。

1.3縮宮素扭體試驗

各組于末次給藥1 h后， 腹腔注射縮宮素2 U/只，立即秒表計時， 以扭體反應（大鼠腹部收縮內凹， 軀干與后肢伸展， 臀部與一側肢體內旋）為子宮收縮痛經指標（注： 不發生扭體反應大鼠的潛伏期按30 min計）。觀察并記錄大鼠出現疼痛的時間（潛伏期）及30 min內的扭體次數，計算扭體抑制率。

扭體抑制率=［（模型對照組扭體次數-給藥組扭體次數）/模型對照組扭體次數］×100%

1.4大鼠血漿前列環素（PGI2）含量測定（測定其代謝產物6-keto-PGF1α來表示）

各組于催產素扭體試驗結束后，腹腔注射體積分數3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉大鼠，經大鼠腹主動脈取血， 肝素抗凝， 3 000 r/min 離心15 min，分離血漿，采用雙抗體夾心ELISA法，按試劑盒操作說明進行血漿PGI2的代謝產物6-酮-前列腺素1α（6-Keto-PGF1α）含量測定。

1.5統計學處理

表1　痛經停貼膏劑對縮宮素誘發大鼠痛經的影響

2　結果

2.1痛經停貼膏劑對縮宮素誘發大鼠痛經的影響

由表1結果可見，與空白對照組比較，模型對照組大鼠扭體反應的潛伏期明顯縮短，30 min內的扭體次數明顯增加，表明縮宮素作用于子宮引起的強烈宮縮可以引起大鼠產生腹痛，發生扭體反應，提示大鼠類痛經模型復制成功。與模型對照組比較，痛經停貼膏劑中、高劑量組大鼠扭體反應的潛伏期明顯延長，高劑量組大鼠30 min內的扭體次數明顯減少，提示痛經停貼膏劑對縮宮素誘發的大鼠痛經具有明顯的鎮痛作用。

2.2痛經停貼膏劑對縮宮素誘發痛經大鼠血漿6-keto-PGF1α含量的影響

由表2結果可見， 與空白對照組比較， 模型對照組大鼠血漿6-keto-PGF1α含量明顯降低。痛經停貼膏劑中、高劑量組血漿6-keto-PGF1α含量均明顯升高， 與模型對照組比較差異具有顯著性（P＜0.05，P＜0.01），提示： 痛經停貼膏劑能升高痛經模型大鼠的6-keto-PGF1α含量，從而達到鎮痛效果。

表2　痛經停貼膏劑對痛經大鼠血漿6-keto-PGF1α含量的影響

3　討論

3.1實驗性痛經模型的選擇

近年來用于制備痛經模型的動物包括豚鼠、SD大鼠、Wistar大鼠、兔及小鼠，其中以Wistar大鼠使用率為最高。Wistar大鼠因性周期較其它動物穩定，故在研究原發性痛經的動物實驗中常常被選用，本研究選取Wistar大鼠。

作者采用腹腔注射縮宮素引起子宮平滑肌痙攣性收縮這一較為公認的在體子宮痙攣（類痛經反應）的病理模型［3］。造模及動物處理參考林喬等［1］的方法，造模使用藥物為戊酸雌二醇和縮宮素。戊酸雌二醇為天然雌二醇的戊酸鹽，具有雌二醇的藥理作用，可增強子宮收縮，提高子宮的敏感性。縮宮素為制備痛經模型時經常使用的致痛藥物，不僅因為其可以直接作用于子宮肌細胞引起子宮收縮，而且還可以同時刺激子宮內膜細胞釋放PGF2α引起痛經［4］。大鼠急性痛經模型制備周期有的為4 d，有的為10 d。有研究表明，大鼠急性痛經模型建立時間以10～15 d為宜［5］。故本研究采用了10 d方案以提高大鼠子宮的敏感度。

3.2痛經停貼膏劑鎮痛作用與血漿PGI2水平

痛經疼痛嚴重影響患者的學習、工作和生活，因此止痛成為首要任務。本實驗中作者在給大鼠戊酸雌二醇溶液灌胃后， 腹腔注射縮宮素， 大鼠出現扭體反應，這是大鼠子宮平滑肌痙攣、疼痛的外在反應和客觀評價方法之一，扭體潛伏期和扭體次數能夠客觀反應大鼠給予縮宮素后所致痛經的情況。

近年來的研究認為，原發性痛經的發病與前列腺素（PG）密切相關。PG在體內合成中有多種代謝物，目前認為與疼痛有關的主要是PGF2α、PGE2、PGI2、TXA2［6］。PGF2α可使子宮張力升高，子宮過度收縮甚至痙攣性收縮而導致痛經。TXA2主要來自血小板，有較強的子宮收縮作用，強力促進血小板凝聚及血栓形成。PGE2可松馳子宮平滑肌。PGI2是一個強有力的血小板聚集抑制劑和血管擴張劑，它可涉及子宮血流動力學的調控，降低PGF2α誘導的肌緊張度。同時PGI2和TXA2是一對既相互拮抗又相互調節的前列腺素，特別是對血管舒縮或血小板聚散活性有強烈的調控作用。血漿或組織中TXA2和PGl2平衡失調是造成血小板聚集， 血管痙攣收縮或血栓形成的原因之一。正常情況下， 血小板表面激活后產生的花生四烯酸在環氧合酶的作用下生成PGI2和TXA2， 二者在循環中的水平處于相對平衡狀態， 共同調節機體微循環和血流動力學功能。鑒于實驗經費所限， 本研究只選擇PGI2作為觀測指標。而PGI2在體內半衰期極短， 為2～3 min。由于PGI2的不穩定性， 目前還難以直接測定， 所以國內外均以測定其穩定無活性的代謝產物6-keto-PGF1α作為判斷其濃度的指標綜上所述，本實驗采用較為公認的腹腔注射縮宮素引起大鼠類痛經反應的病理模型，評價了痛經停貼膏劑的鎮痛作用，并初步探討了其治療痛經的作用機制。實驗結果表明，痛經停貼膏劑中高劑量組能延長大鼠扭體反應潛伏期，高劑量組能減少大鼠扭體反應次數，能夠明顯提高大鼠血漿6-keto-PGF1α水平，說明痛經停貼膏劑可以抑制大鼠扭體反應，具有明顯的鎮痛作用，其鎮痛作用機制可能與提高血漿PGI2水平有關。

［1］林喬， 陳建南， 賴小平， 等. 川芎提取物對實驗性痛經的鎮痛機制［J］. 中國實驗方劑學雜志， 2011， 17（10）：161.

［2］中國畜牧獸醫學會. 中國獸醫針灸學［M］. 北京： 農業出版社， 1984：213.

［3］劉敏如， 譚萬信. 中醫婦產科學［M］. 北京： 人民衛生出版社， 2001：323.

［4］嵇波， 張露芬， 朱江， 等. 痛經模型建立和評價方法的思考［J］. 中國藥理學通報， 2008， 24（6）：711.

［5］孫海燕， 曹永孝， 劉靜， 等. 小鼠痛經模型的建立［J］. 中國藥理學通報， 2002， 18（2）：233.

［6］傅金榮. 子宮內膜異位癥致疼痛的研究概況［J］. 上海中醫藥雜志， 1997， （6）：16.

Evaluation on Analgesic Effect of Tongjingting Paste in Rats Model with Experimental Dysmenorrhea

LIU Jin， SUI Zai-yun， HOU Wen-jing
（Shandong Academy of Chinese Medicine， Jinan 250014， China）

ObjectiveTo evaluate the analgesic effect of tongjingting paste in rats model with experimental dysmenorrhea and to reveal its analgesic mechanism. MethodsThe experimental dysmenorrheal model in rats was induced with oxytocin. A writhing test was employed to evaluate the analgesic effects of tongjingting paste， which was designed into different doses， in animal subjects. The contents of 6-keto-PGF1α in the blood plasma were observed by ELISA assay. ResultsTongjingting paste has a significant analgesic effect on experimental dysmenorrheal model in rats. Latent period was delayed significantly， the number of writhing response was evidently decreased as well. Besides， 6-keto-PGF1|á were significantly increased in the treated groups. ConclusionTongjingting paste had a significant analgesic effect on experimental dysmenorrheal model in rats. Its analgesic mechanism may be mediated by regulating the plasma levels of 6-keto-PGF1α.

Tongjingting paste； Experimental dysmenorrheal； Writhing reaction； 6-keto-PGF1α； Rat

Q95-33

B

1674-5817（2015）02-0167-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.02.016

2014-06-30

山東省中醫藥科技發展計劃項目（No. 2011-165）

劉瑾（1973-）， 女， 碩士， 副研究員， 主要從事中藥復方藥效作用機理及安全性評價工作。E-mail： jinanlj56@163.com

隋在云（1964-）， 女， 碩士， 研究員， 主要從事中藥及其有效成分的藥效物質基礎研究及安全性評價工作。E-mail： zy_505@163.com