母體糖尿病環境對體外受精胚胎早期發育的影響

強蘇靜，陶凌云，劉麗均，徐　平，3，高　誠

（1. 上海斯萊克實驗動物有限責任公司，上海 201615；2. 上海實驗動物研究中心，上海 201203；3. 中國科學院上海生命科學院，上海 201615）

母體糖尿病環境對體外受精胚胎早期發育的影響

強蘇靜1，陶凌云2，劉麗均1，徐平1，3，高誠2

（1. 上海斯萊克實驗動物有限責任公司，上海 201615；2. 上海實驗動物研究中心，上海 201203；3. 中國科學院上海生命科學院，上海 201615）

目的通過腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）構建小鼠糖尿病（diabetes mellitus，DM）模型后， 運用體外受精技術研究母體高血糖環境對早期胚胎發育的影響。方法選取6～8周齡ICR雌鼠經2次腹腔注射小劑量STZ構建小鼠糖尿病模型，并設實驗對照組。實驗母鼠體外受精得到2-細胞胚胎，統計受精率等，并將2-細胞胚胎移植至代孕母鼠體內。取14 d胎齡的胚胎提取總RNA，用Agilent 2100 Bioanalyzer系統對總RNA進行質檢合格后，經過逆轉錄、標記、雜交、洗脫，芯片結果用Affymetrix Scanner 3000進行掃描，用Command Console Software 3.1讀取原始數據，實驗重復3次，比較實驗組與對照組的基因表達的差異情況。結果較高血糖組（血糖為9.5～15.5 mmol/L）母鼠卵子體外受精后發育到2-細胞胚胎的比例為52.3%與對照組的72.1%存在顯著統計學差異（P＜0.01），高血糖組（血糖值＞15.5 mmol/L）胚胎發育到2-細胞的比例為44.2%與對照組相比也存在顯著統計學差異（P＜0.01）。芯片篩選出差異表達基因121個（P＜0.05），其中有119個基因實驗組的表達量是對照組的0.5倍以下，2個基因實驗組的表達量是對照組的2倍以上。結論糖尿病小鼠的卵子與正常精子體外受精后發育到2-細胞的比例較對照組小鼠低，并且血糖值越高比例越低。由此說明母體糖尿病環境能影響其卵子的生長發育，并且這些影響可能是通過上調代謝相關基因和下調發育相關基因產生的。

鏈脲佐菌素（STZ）； 體外受精； 基因芯片； 差異表達

代謝疾病如肥胖癥、糖尿病和心血管疾病已成為一個世界范圍內的社會和健康問題，為深入研究這些疾病的發病機理，利用動物模型進行研究是有效途徑之一。作者前期實驗表明，用正常ICR雄鼠與糖尿病模型雌鼠交配，受精率僅為46.9%，流產率高達73.9%，胚胎畸形率為9%，仔鼠出生死亡率為20%［1］。因此本實驗采取體外受精的方法，排除母體本身在交配環節對受精率的影響著重研究高血糖母體對卵細胞的影響，并且這種影響是否持續到胚胎發育期。

研究認為［2］，糖尿病胎兒發育異常與基因表達改變有關，糖尿病引起的神經管缺失與神經管表面的細胞凋亡有關，并觀察到糖尿病小鼠胚胎中腦和后腦的神經管中Pax-3 mRNA表達明顯下降； 對鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）誘發的大鼠糖尿病模型研究表明，12 d胚胎的卵黃囊細胞膜的損傷與細胞凋亡信號調節通路的破壞有關， 發現卵黃囊細胞凋亡相關基因Bax蛋白表達上升，而細胞生存因子Akt酶活力下降［2］。本實驗通過基因芯片的方法檢測高糖母體的體外受精胚胎中的一些基因表達情況，并與正常對照組進行比較，研究糖尿病與這些基因表達的相關性，為后續實驗提供研究方向

1　材料與方法

1.1實驗動物與環境條件

SPF級雌性ICR小鼠，6～8周齡，28～30 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司［SCXK（滬）2008-0016］，飼養于上海實驗動物研究中心（上海市實驗動物質量監督檢驗站）屏障系統內［SYXK（滬）2008-0056］， 密度≤5只/每盒， 溫度20℃～24 ℃，相對濕度40%～60%，喂以配方飼料，自由采食和飲水，自動光控（12 h/12 h）。

1.2試劑及儀器

鏈脲佐菌素（STZ）、超促排卵所需激素（PMSG、hCG）、配置胚胎體外培養液HTF所需試劑、胚胎沖洗液M2均購自Sigma公司；枸櫞酸鈉為國產分析純； 血糖試紙為羅氏公司產品；RNA抽取試劑盒（RNeasy Mini Kit）購自Qiagen公司； 小鼠RNA表達譜芯片為Affymetrix Mouse 430 2.0芯片（上海伯豪生物技術有限公司，生物芯片上海國家工程研究中心）。另有羅氏羅康全活力型血糖測定儀（羅氏公司）； 紫外分光光度儀ND-1000（NanoDrop），Stemi2000C顯微解剖鏡（Zeiss公司）； Micro Galaxy CO2培養箱（60 mm×15 mm）（Becton Dickinson公司）； GeneChip?Scanner 3000 掃描儀（Cat#00-00212，Affymetrix， Santa Clara， CA， US）等。

1.3糖尿病動物模型的建立

將實驗小鼠分為實驗組和對照組， 實驗組30只，對照組15只。實驗組用0.05 mmol/L pH 4.5 的無菌枸櫞酸鈉緩沖液配制成10 mg/mL的STZ溶液后按10 mL/kg體質量的劑量腹腔注射（即小鼠腹腔注射STZ的劑量為100 mg/kg體質量），對照組腹腔注射按10 mL/kg體質量注射無菌枸櫞酸鈉緩沖液，1 周后按上述劑量再次腹腔注射實驗組和對照組小鼠。將空腹血糖值9.5～15.5 mmol/L作為較高血糖模型小鼠， 血糖值＞15.5 mmol/L為高血糖小鼠， 觀察并記錄小鼠癥狀、體征和死亡情況。

1.4血清葡萄糖濃度和體質量測定

每次注藥后一周測定實驗組和對照組小鼠的血清葡萄糖濃度和體質量，采用空腹尾尖采血，直接用血糖試紙測定。

1.5實驗小鼠的超促排卵和體外受精

實驗組和對照組小鼠用6 IU PMSG和hCG進行超排卵。注射hCG 14 h后， 小鼠脫臼處死。取出雌鼠的卵子與正常的ICR雄鼠的精子進行體外受精。體外受精24 h后， 計數發育到2-細胞的胚胎。并將2-細胞胚胎轉移入正常的同期假孕雌鼠的輸卵管內， 12.5 d后剖宮取14 d胚胎。由于高血糖組雌鼠體外受精后得到的2-細胞比較少，發育狀態也不佳，故未做移植。

1.614 d胚胎總RNA提取

分別提取10個實驗組和10個對照組14 d胚胎總RNA， 操作按試劑盒進行。紫外分光光度計測定總RNA/DNA濃度（260 nm）， 經紫外波譜掃描分析RNA/DNA純度，D260/D280值在2.0左右，D260/D230值＞D260/D280值，說明核酸純度較高。

1.7芯片實驗與數據分析

采用Affymetrix表達譜芯片配套試劑盒和標準操作流程對實驗組和對照組胚胎總RNA中的mRNA進行放大、標記和純化， 獲得帶有生物素（biotin）標記的cRNA。按照Affymetrix表達譜芯片配套提供的雜交標準流程和配套試劑盒， 在滾動雜交爐中16h滾動雜交， 雜交完成后在洗滌工作站按照Affymetrix提供的標準操作流程進行芯片的洗滌。芯片結果采用Gene Chip?Scanner 3000進行掃描，用Command Console Software 3.1讀取原始數據， 質控合格的數據采用Gene Spring Software 11.0進行歸一化處理，所用的算法為MAS5.0。基因表達差異用差異倍數值（foldchange）表示， 差異基因的篩選標準為差異倍數值≥2為上調基因， 差異倍數值≤0.5為下調基因。

1.8統計學方法

所有數據用Mean±SE表示， 采用SPSS19.0 軟件進行統計學處理。差異顯著性檢驗采用獨立樣本t檢驗和單因子方差分析（one way ANOVA）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1糖尿病模型

對實驗組30只雌性小鼠第一次注射STZ后一周，小鼠血糖與對照組無明顯差異， 體質量小幅下降（圖1），不表現多飲、多食、多尿， 活動正常； 第二次注射STZ后1周， 76.6%的小鼠血糖值≥9.5 mmol/L， 其間表現多飲、多食、多尿， 活動減少， 體質量下降明顯（圖1）， 沒有出現小鼠死亡。由圖2可見， 63.3%小鼠血糖值（12.08±0.47 mmol/L， n=19）明顯升高， 較對照組（6.16±0.24 mmol/L， n=15）有顯著統計學差異（P＜0.001）， 其中13.3%小鼠血糖值＞15.5 mmol/L （n=4）。

2.2實驗小鼠體外受精后的2-細胞比例

由圖3可見，模型小鼠超排卵子與正常雄鼠的精子體外受精后， 卵子的個數較正常小鼠少， 并且發育到2-細胞的個數較少。由表1可見，較高血糖組小鼠超排后卵子與正常雄鼠的精子體外受精后，發育到2-細胞的比例為52.6%， 較對照組72.1%有統計學差異（P＜0.01），高血糖組小鼠超排后卵子與正常雄鼠的精子體外受精后，發育到2-細胞的比例為43.3%，較對照組亦有統計學差異（P＜0.01）。

2.3芯片雜交

共檢測了45 101個點， 檢出25 978個點， 檢出率為57.6%， 圖4為基因芯片雜交信號強度的散點圖。X軸、Y軸分別以實驗組g1和對照組g2的熒光強度值為坐標， 每一個數據點代表芯片上一個基因點的雜交信號， 數據點顏色越紅表示雜交信號越強

2.4差異基因分析

共檢出差異表達基因121個（P＜0.05），其中有119個基因表達量下調，2個基因表達量上調。這些基因包括發育因子、細胞因子、信號轉導蛋白、代謝酶、轉錄調節因子、免疫調節因子和一些Cdna（圖5）。發現部分差異基因與胚胎發育和代謝有關，部分基因如表2示，另觀察到一些印跡基因在實驗組和對照組表達有差異（表3）。

圖1　小鼠體質量變化平均值Figure 1 Average value about weight change in treated mice

圖2　STZ處理后實驗小鼠血糖平均值Figure 2 Average value about blood glucose levels in treated mice

圖3　實驗組（左圖）與對照組（右圖）單只母鼠卵細胞體外受精后的2-細胞胚胎（× 80）Figure 3 Two-cell embryos of treated group （left） and control group （right） after in vitro fertilization（× 80）

表1　實驗小鼠體外受精后的受精率Table 1 The ratio of fertilization after in vitro fertilization

圖4　胚胎的熒光強度值Figure 4 Fluorescence intensity value of the embryo

圖5　胚胎差異基因功能分布圖Figure 5 Distribution figure of embryo's different genes function

表2　胚胎部分差異顯著基因簡略表Table 2 Brief table of partial embryo's different expression genes

3　討論

前期實驗表明，用正常的雄性小鼠與糖尿病雌鼠交配，其受精率可能與母體的高血糖有關［1］。因此本實驗采取體外受精的方法，排除母體環境對受精率的影響，而主要研究高血糖的母體對卵細胞的影響。將模型小鼠用PMSG和hCG超促排卵后，與正常精子進行體外受精， 經過24 h的體外培養后，發現模型小鼠的胚胎發育到2-細胞的比例明顯低于對照組的小鼠，且血糖越高比例越低，這可能與母體的高血糖有關。林錕等研究了高血糖對卵母細胞和早期胚胎細胞凋亡的影響，結果表明糖尿病小鼠的卵泡破裂和卵母細胞減數分裂時間都比正常小鼠延遲，卵母細胞大小較正常明顯減小［3］。體外細胞培養亦觀察到高濃度葡萄糖環境下排卵后卵母細胞培養存活率下降，提示高糖對卵母細胞存在著一定的細胞毒性作用，母體的高血糖對其卵子的發育是有不良影響的［4］。本實驗將模型小鼠的卵子與正常小鼠的精子體外受精，發現受精率偏低，鑒于精子是正常的，排除精子對受精率的影響后，表明受精率偏低主要是由于卵子質量下降引起的。本實驗得出的結果和林錕等研究是一致的，而且是從胚胎發育學角度來證明高糖對卵母細胞存在著一定的細胞毒性作用，并為其提供實驗依據。

表3　胚胎印跡基因表達差異Table 3 Different expression of placenta's imprinting genes

本實驗通過基因芯片檢測出差異表達基因121個， 其中有119個基因表達量下調， 2個基因表達量上調。其中差異較明顯的印跡基因有Xist、Xlr4c、Grb10（growth factor receptor-bound protein 10）、Meg3、Impact、Gab1、Sgce、Phlda2等。X染色體失活特異轉錄物（X inactive transcript， Xist）是母源印跡基因，它是一種非編碼的RNA。Xist基因在X染色體失活過程中起著關鍵性作用［5］，Xist的表達為雌性胚胎發育過程中X染色體失活的起始和劑量補償所必需。印跡基因Grb10為母源等位基因表達，Grb10基因干擾導致小鼠胚胎及胎盤的過渡生長，以致出生時胎兒及胎盤均比正常的大30%左右，說明Grb10是強大的生長抑制劑［6，8］。在小鼠上，Gab1基因定位于染色體8C31，Gab1在小鼠的胚胎期就開始表達，利用基因敲除研究Gab1的基因功能顯示， Gab1基因敲除小鼠于胚胎期12.5～17.5 d死亡，并表現出胎盤、心臟、皮膚等多器官發育障礙［7，9］。Sgce （Epsilon-Sarcoglycan） 基因是父源等位基因表達，Sgce基因在早期和晚期胎盤中呈現組成性的高表達，且Sgec基因純合性缺失的小鼠胚胎由于無法著床而死去，提示該基因的表達產物可能在細胞增殖、分化和滋養層細胞侵入子宮壁的過程中，對細胞之間的信號轉導起著重要作用［10］。Phlda2在胎盤中是父源印跡、母源表達的基因，表達于人胎盤絨毛的細胞滋養層及小鼠胎盤迷路滋養層。Phlda2通過參與不同滋養層細胞間的信號轉導，使各滋養層按比例協調生長，維持胎盤功能的穩定［11］。Phlda2基因敲除的小鼠，胎盤過度增生，但以海綿滋養層增生為主，母-胎營養傳遞的關鍵部位一迷路滋養層的比例相對減少，且胎盤毛細血管數量減少［11］。

上述幾個印跡基因與胚胎和胎盤的發育密切相關，本實驗中小鼠母體的高血糖環境可能是引起這些基因異常表達的重要原因之一，因實驗設置了同樣進行體外受精的對照組，故胚胎體外操作的影響可以忽略不計。這些基因的異常表達是否引起胚胎發育乃至成年期以后的異常，將通過后續研究進行驗證。通過篩選出這些差異基因，為進一步研究糖尿病影響胚胎的遺傳發育和代謝性疾病的分子機理提供了基礎數據。

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Effect of Maternal Diabetic Environment on Development of Early Mouse Embryo by in vitro Fertilization

QIAANG Su jing1， TAO Ling-yun2， LIU Li-jun1， XU Ping1，3， GAO Cheng2
（1. Shanghai SLAC Laboratory Animal Ltd. Co.， Shanghai 201615 China；2. Shanghai Laboratory Animal Research Center， Shanghai 201203， China；3. Shanghai Institute for Biological Sciences， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 201615， China）

ObjectiveThe experimental mice were induced to be diabetes mellitus （DM） mice through streptozotocin （STZ） intraperitoneal injection， in order to study the effect of maternal hyperglycemia on early mouse embryo development by in vitro fertilization. MethodsICR mice aged 6～8 weeks were intraperitoneally injected with STZ to established DM models， and the normal mice were considered as control group . The model mice were superovulated by intraperitoneal injection with PMSG and hCG， then the oocytes were fertilized with sperms from normal male mice in vitro. The rates of fertilization were counted and 2-cell embryos were transferred to pseudopregnant mice. Finally 14-dold embryos were obtained to extract. total RNA. After detected by Agilent 2100 Bioanalyzer system，total RNA were reversed transcription， labeled， hybridized， eluted and the data of microarray was scanned by Affymetrix Scanner 3000. Basic data were read by Command Console Software 3.1. The experiments were repeated three times， then the expression of genes between treated group and control group were compared. ResultsThe ratio of two-cell embryo in hyperglycemia group （52.3%）， was significantly lower than that in the control group （77.2%） （P＜0.01）. A total of 121 differentially expressed genes （P＜0.05） were screened out. One hundred and nineteen genes expression levels of the experimental group was less 0.5 times than those of the control group， while 2 genes showed a more than 2-fold up regulation. ConclusionAfter oocytes of model mice fertilizing with sperms of normal male mice in HTF， the rate of embryo developing to two-cell was lower than normal mice. The higher of blood glucose level， the lower of two-cell rate. The growth and development of the oocytes were affected by maternal diabetes environment through up-regulating the metabolism-related genes and down-regulated development-relating genes .

Streptozotocin（STZ）； In vitro fertilization； Microarray； Differentially expression

Q95-33

A

1674-5817（2015）02-0155-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.02.014

2014-06-30

上海市科委“創新行動計劃”重點項目（10140900700）； 國家科技支撐計劃課題（2013BAK11B02）

強蘇靜（1987-）， 女， 碩士研究生， 研究方向： 動物學。liyang_sujing@163.com

高誠， 研究員。E-mail： gaochengdgb@126.com