紅藍熒光細胞的構建

王真，施新顏，陳宇

（杭州市婦產科醫院　檢驗科，浙江　杭州　310008）

·技術與方法·

紅藍熒光細胞的構建

王真，施新顏，陳宇

（杭州市婦產科醫院檢驗科，浙江杭州310008）

目的：構建人組蛋白H2B基因與藍色熒光蛋白（BFP）融合的真核表達質粒，使其能在黑色素瘤細胞（B16細胞）中表達，形成在核區可以發出肉眼可見的藍色熒光，胞質區發出肉眼可見紅色熒光的雙色熒光細胞。方法：采用普通PCR擴增得到BFP序列，通過反轉錄PCR（RT-PCR）從含有腺病毒E1A基因的人腎上皮細胞（293細胞）中擴增獲得H2B基因的部分cDNA序列。將BFP序列、H2B基因與pRetroX-Tight-Pur載體質粒來構建真核表達質粒（pRetroX-BFP-H2B），對其進行酶切并用普通PCR方法進行鑒定。采用脂質體轉染技術將pRetroX-BFP-H2B重組質粒轉染細胞質中能表達紅色熒光蛋白（RFP）的B16細胞并觀察融合蛋白的表達。結果：成功構建pRetroX-BFP-H2B質粒，經轉染后的雙熒光細胞可以呈現出雙熒光的效果，轉染后也能穩定地表達傳代。結論：本研究為雙色熒光細胞的構建及其熒光蛋白種類的選用提供了新的參考。

H2B基因；藍色熒光蛋白；黑色素瘤細胞；真核表達質粒

熒光蛋白在生物感應器中的巨大應用潛力逐漸被開發出來。利用細胞結構組成信息開發出來的探針可以不斷提高生物感應器的敏感度。目前利用熒光蛋白標記細胞核染色體并跟蹤觀察的技術已經比較成熟，熒光標記技術的成功標志著大部分的生物參數可以采用以熒光蛋白為基礎的生物感應器進行測量。故本研究希望通過探索紅藍熒光細胞的構建，為細胞熒光定位設計提供新的思路。

1　材料和方法

1.1材料 pRetroX-Tight-Pur載體質粒、PAAV3質粒、黑色素瘤細胞（B16細胞）、人腎上皮細胞（293細胞）、H5α菌種（均由中國疾病控制中心病毒病所提供）；限制性內切酶Mlu1、EcoR1、BamH1，T4 DNA連接酶，Pyrobest DNA聚合酶，rTaq DNA聚合酶（均由TaKaRa公司提供）；質粒小提試劑盒（由天根生化科技有限公司提供）；普通DNA產物純化試劑盒（由天根生化科技有限公司提供）；RNAisoTM Plus試劑盒（由TaKaRa公司提供）；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2（由TaKaRa公司提供）；胎牛血清（由杭州四季青生物工程材料有限公司提供）；Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM（由美國GIBCO/BRL公司提供）；氨芐青霉素（由上海生工生物工程技術服務有限公司提供）；LD12000 DNA Marker LD12000（由TaKaRa公司提供），核酸染料（由北京博潤萊特科技有限公司提供）；溴酚藍指示劑（由TaKaRa公司提供）。

1.2實驗方法

1.2.1藍色熒光蛋白（BFP）基因的提取與處理：①BFP基因的提取：搖床設置37 ℃ 220 r/min，挑取含PAAV3質粒（含BFP基因）的單克隆菌落置于2 mL LB液體培養基中，于搖床中振蕩培養過夜，按照質粒小提試劑盒中說明書的方法提取該單克隆菌落中的PAAV3質粒。將提取后的PAAV3質粒進行普通PCR，以獲得兩端具有Mlu1與EcoR1兩個酶切位點的BFP基因片段。獲得目的條帶大小應為742 bp，通過凝膠電泳觀察其大小及亮度。引物序列為：

②BFP基因片段的酶切：通過普通PCR擴增獲得的BFP的DNA片段，先用普通DNA產物純化試劑盒將其純化，然后在Mlu1和EcoR1雙酶切作用下，置于37 ℃水浴中過夜。酶切結束后，通過凝膠電泳觀察片段的亮度與大小。

1.2.2pRetroX-Tight-Pur載體質粒的提取：①pRetroX-Tight-Pur載體質粒的提取：設置搖床37 ℃220 r/min，挑取含pRetroX-Tight-Pur載體質粒的單克隆菌落于2 mL LB液體培養基中，置于搖床中振蕩培養過夜，將菌液分裝于4個EP管，按照質粒小提試劑盒說明書中的方法提取pRetroX-Tight-Pur載體質粒。載體質粒大小為6 568 bp，凝膠電泳觀察其大小及亮度。②pRetroX-Tight-Pur載體質粒的酶切：由于該質粒中Mlu1和EcoR1的酶切位點相鄰，所以先用MIu1酶切2 h后，經電泳鑒定已大致酶切完全，再加入EcoR1酶切，于37 ℃水浴中過夜。酶切后進行凝膠電泳，并觀察載體質粒DNA的大小與亮度。

1.2.3BFP基因的插入：將酶切獲得的BFP基因片段與pRetroX-Tight-Pur載體質粒分別用普通DNA產物純化試劑盒純化。然后通過對BFP基因片段與pRetroX-Tight-Pur載體質粒大小及相應濃度的估計，調整載體與目的片段的量使其在酶切與連接體系中的濃度比在1∶3～1∶10之間，使用T4連接酶于16 ℃水浴并對其連接過夜。

1.2.4pRetroX-BFP重組質粒的鑒定：①pRetroXBFP重組質粒轉化入感受態細菌：將pRetroX-BFP重組質粒轉化感受態大腸桿菌H5α。②單克隆菌落的挑取與培養：次日觀察平板，發現長有約50～60株菌落，挑取10株形狀規則的菌落分別置于含氨芐青霉素的2 mL LB液體培養基的試管中，并標記為1～10號，置于37 ℃ 220 r/min搖床上培養16 h。③pRetroX-BFP重組質粒的提取與鑒定：按照質粒小提試劑盒提取pRetroX-BFP重組質粒的DNA，取1 μL DNA稀釋成30 μL溶液進行普通PCR鑒定，產物經凝膠電泳后觀察，挑選陽性株。④重組子的酶切鑒定：將各管提取的質粒溶液置于37 ℃水浴中，并用MIu1 和EcoR1雙酶切2.5 h，再進行電泳觀察其酶切結果。根據普通PCR和酶切結果的鑒定，挑選質粒重組成功的菌株，將該菌種與含60%甘油的凍存液600 μL 以1∶1的比例保種。

1.2.5人組蛋白H2B基因的cDNA制備：①B16細胞RNA的提取：按照RNAisoTM Plus試劑盒說明書中的方法提取B16細胞中的總RNA，室溫干燥沉淀2～5 min（不可以離心或加熱干燥，否則RNA將會很難溶解），加入適量的RNase-free水溶解沉淀，必要時可用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后置于-80 ℃冰箱保存。②H2B核定位信號的cDNA制備：采用PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver 2試劑盒將以上提取的總RNA進行反轉錄PCR（RT-PCR），引物序列為：

RT-PCR結束后，采用普通DNA產物純化試劑盒純化DNA片段，獲得的基因兩端酶切位點為Mlu1與BamH1，取2 μL進行電泳并觀察結果，獲得目的基因大小應為400 bp左右，濃度約為10 ng/μL。取約2 μg純化后的H2B DNA片段，在37 ℃水浴中用Mlu1 和BamH1雙酶切過夜，通過凝膠電泳觀察酶切后DNA片段的亮度。

1.2.6pRetroX-BFP-H2B重組質粒的制備：①pRetroXBFP載體質粒的酶切處理：取約2 μg已構建的pRetroXBFP載體質粒，在37 ℃水浴中用Mlu1和BamH1雙酶切過夜。用普通DNA產物純化試劑盒對酶切后的pRetroX-BFP載體質粒進行純化，再取2 μL純化后質粒進行凝膠電泳并觀察質粒亮度。②pRetroX-BFPH2B重組質粒的制備：根據凝膠電泳中的質粒亮度估算質粒濃度，調整載體質粒與H2B DNA片段在酶切與連接體系中的終濃度比。為能得到較好的重組結果，將酶切后得到的H2B cDNA與BFP-pRetroX在20 ℃水浴中連接2.5 h。

1.2.7pRetroX-BFP-H2B重組質粒的鑒定：①單克隆挑取與鑒定：將重組子轉化入感受態細胞，并均勻涂布于含有氨芐青霉素的LB平板培養基，在37 ℃的培養箱中培養過夜。次日觀察，菌落約70個。挑取9個菌落于含有氨芐青霉素的LB液體培養基，并分別標號1～9號，置于37 ℃ 220 r/min的搖床培養3.5 h。分別吸取2 μL菌液進行普通PCR反應進行鑒定，并以等量的ddH2O與H2B cDNA作對照，再通過凝膠電泳觀察結果。②酶切鑒定：將凝膠電泳中條帶明亮清晰的菌株，加入含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，置于37 ℃ 220 r/min的搖床培養過夜。將培養過夜的菌液用質粒小提試劑盒提取DNA質粒，加入EcoR1與BamH1酶于37 ℃水浴1.5 h，同時用pRetroX-BFP作為對照，酶切結束后通過凝膠電泳觀察結果。

1.2.8pRetroX-BFP-H2B重組質粒的大量制備：采用QIANGEN質粒提取試劑盒并按照其說明書中的方法大量制備pRetroX-BFP-H2B重組質粒，提取獲得的質粒經分光光度計測值后得到的數據為：濃度為0.078 μg/μL，260/280=1.82，260/230=2.05。

1.2.9轉染：選用細胞質中能表達紅色熒光蛋白（RFP）的B16細胞，采用脂質體法將pRetroX-BFPH2B重組質粒轉染至B16細胞中。

1.2.10嘌呤霉素篩選培養基的配置：取嘌呤霉素鹽酸鹽（規格為25 mg），用5 mL去離子水完全溶解后過濾除菌，分裝至EP管。取200 μL嘌呤霉素鹽酸鹽溶液，加含10%胎牛血清的DMEM培養基配置成篩選培養基母液1 mL，濃度為1.0 mg/mL。取3只EP管中各加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM培養基，再分別加入1.0 mg/mL的培養基母液10、15和20 μL，配成嘌呤霉素終濃度為1.0、1.5和2.0 μg/mL的篩選培養基，用于質粒轉染細胞的篩選。

1.2.11質粒轉染細胞的篩選：用1.0、1.5和2.0 μg/mL的3個濃度的培養基分別培養被質粒轉染的細胞，在第10～第15天內細胞全部死亡的最低濃度為1.0 μg/mL，選擇該濃度為篩選培養基。當細胞大量死亡時撤去篩選培養基改用普通培養基培養。篩選培養期間定期用熒光顯微鏡觀察細胞的熒光效果。

2　結果

2.1pRetroX-BFP-H2B重組質粒轉染B16細胞的熒光激發結果 B16細胞經pRetroX-BFP-H2B重組質粒轉染72 h以后，在熒光顯微鏡下觀察其結果。如圖1所示，在紫光激發下，對照組細胞（pRetroX-BFPH2B重組質粒未轉染B16細胞）中有隱約的紅色熒光，實驗組細胞（pRetroX-BFP-H2B重組質粒轉染B16細胞）中可以觀察到藍色熒光與暗紅色熒光。

圖1　pRetroX-BFP-H2B重組質粒轉染B16細胞72 h后的熒光激發圖（×400）

用1.0 μg/mL的嘌呤霉素篩選培養基篩選對照組細胞和實驗組細胞6 d后，在熒光顯微鏡下用紫光及綠光激發并觀察其結果。如圖2所示，在紫光激發下，對照組細胞中有較多細胞死亡，大多數死亡細胞呈球形漂浮于培養基中并無藍色熒光，少部分細胞仍表現非特異性紅色熒光。實驗組細胞中可以觀察到大多數細胞的胞漿呈非特異性紅色熒光，細胞輪廓與形態清晰可見，而其中央區域則呈圓點狀的藍色熒光。在綠光激發下，對照組細胞中的死亡細胞依然能夠呈現紅色熒光，實驗組細胞能呈現強紅色熒光，與紫光激發下的熒光效果對比強烈。

2.2各質粒轉染細胞不同時間長度的熒光結果 對照組細胞分別為：pRetroX-BFP-H2B重組質粒轉染B16（不含RFP）細胞、pRetroX-BFP-H2B重組質粒轉染293細胞和PAAV2-EGFP表達載體轉染293細胞。如圖3所示，pRetroX-BFP-H2B重組質粒轉染B16（不含RFP）細胞24 h，基本不可見熒光的激發，pRetroXBFP-H2B重組質粒轉染B16（不含RFP）細胞96 h，已可見視野中有數量不少的藍色熒光，但亮度微弱。與pRetroX-BFP-H2B重組質粒轉染293細胞24 h和PAAV2-EGFP載體質粒轉染293細胞24 h作為陽性對照相比，pRetroX-BFP-H2B重組質粒轉染BFP在細菌中的表達量較差。

圖2　嘌呤霉素篩選細胞6 d后的熒光激發圖（×400）

圖3　各質粒轉染細胞不同時間長度的熒光激發圖（×400）

3　討論

熒光蛋白如綠色熒光蛋白（GFP）、增強型綠色熒光蛋白（EGFP）、黃色熒光蛋白（YFP）、增強型黃色熒光蛋白（EYFP）等的熒光效果好，在生物學研究中的采用都較為廣泛，而BFP的熒光亮度普遍都比較低，要求的激發光條件又比較高，因此其在生物學研究中的應用比較少。本研究中選取的熒光蛋白為BFP和RFP，一是運用紅色熒光與藍色熒光的顏色有較大的反差，以及兩者在對方激發光源下的非特異性激發效果低，方便對比觀察；二是BFP在標記上的應用較少。通過本研究可以進一步了解BFP在實際應用中的情況。

通過將轉染成功的細胞在熒光顯微鏡下觀察，可以見到藍色熒光在細胞質中呈圓點狀分布，從而可以確定BFP和H2B基因已重組入表達載體，但是BFP是否只在細胞核內表達仍需進一步實驗確定。通過10多天的轉染、細胞的篩選培養及觀察，得到真核表達載體能整合入真核細胞的染色體組中并形成穩定轉染，其重組后的基因并不容易隨著細胞的傳代而丟失。但是BFP熒光強度較弱，如何提高BFP的表達量或改善BFP的熒光強度并使其在科研中被更為廣泛的應用是目前所必須解決的問題。

本研究將H2B融合BFP基因入核來構建細胞質與細胞核表達不同顏色的雙色熒光蛋白細胞。該雙熒光細胞可以呈現出雙熒光的效果，轉染后也能穩定地表達傳代，為細胞質細胞核雙染色在細胞的生理、病理形態學變化觀察提供了一定的可借鑒方法，并為雙熒光細胞的構建以及其熒光蛋白種類的選用提供了新的參考，為今后成熟地選用熒光蛋白標記與熒光蛋白的定位做了初步的探索和準備。

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（本文編輯：吳昔昔）

Construction of red and blue fluorescent cells

WANG Zhen， SHI Xinyan， CHEN Yu. Department of Clinical Laboratory， Hangzhou Women’s Hospital， Hangzhou， 310008

Objective: To construct the eukaryotic expression plasmid of BFP-H2B and express it in the B16 mouse melanoma cells which can already express red fluorescence protein （RFP） in the cytoplasm， and make the cells’ nucleus show blue light while the plasmid show red light when activated by suitable light wave. Methods: The blue fluorescence protein （BFP） was acquired with PCR from a constructed PAAV3， and H2B gene was obtained with RT-PCR from cultured 293 cell’s total RNA. The sequence encoding H2B and the sequence encoding BFP were inserted into pRetroX to construct the eukaryotic expression vector pRetroX-BFP-H2B. After the constructed plasmid was confirmed by enzymatic digestion and PCR digestion， the recombination plasmid was transfected into B16 mouse melanoma cells which could already express RFP in the cytoplasm by the lipofectamine transfection technology for observation of the fusion protein’s expression. Results: The transfection of double fluorescent cells could present a double fluorescent effect， and stably expresssd batches after successfully constructed the eukaryotic expression plasmid of BFP-H2B. It provided a new reference for the construction of double fluorescent cells and the selection of the fluorescent protein species. Conclusion: In this study we establish an available survey system for the study of the two color fluorescence cells and the selection of fluorescence proteins used.

gene H2B； blue fluorescence protein； melanoma cells； eukaryotic expression plasmid

Q78

B DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.12.009

2014-12-15

王真（1985-），女，山東日照人，檢驗師，碩士。