丙泊酚對大鼠S1區錐體神經元電壓門控鈉離子通道及動作電位的影響

何炯策，張宇，劉興奎，喻田

（1.溫州醫科大學附屬第二醫院　麻醉科，浙江　溫州　325027；2.遵義醫學院　麻醉學系，貴州　遵義563003）

·論 著·

丙泊酚對大鼠S1區錐體神經元電壓門控鈉離子通道及動作電位的影響

何炯策1，張宇2，劉興奎2，喻田2

（1.溫州醫科大學附屬第二醫院麻醉科，浙江溫州325027；2.遵義醫學院麻醉學系，貴州遵義563003）

目的：觀察丙泊酚對大鼠感覺皮層（S1）區神經元電壓門控鈉離子通道及動作電位的影響。方法：制備SD大鼠（鼠齡7～14 d）腦片，采用全細胞膜片鉗技術測定電流及電壓。加入不同濃度（10、30、100、300 μmol/L）丙泊酚，記錄各組神經元鈉電流（INa），繪制電流電壓（IV）曲線、穩態激活曲線、穩態失活曲線及去失活曲線并計算相關參數。向神經元施加幅度50 pA、刺激時程30 ms的去極化刺激電流，記錄各組神經元動作電位。結果：丙泊酚呈濃度依賴性抑制大鼠S1區神經元電壓門控性INa，加快鈉通道的失活過程，使穩態失活曲線向超極化方向移動，延緩鈉通道失活后的恢復，但并不影響鈉通道的激活過程。丙泊酚呈濃度依賴性（濃度為10、30、100 μmol/L）抑制大鼠S1區神經元動作電位的超射值（P＜0.01），對電位閾值有一定的影響（100 μmol/L，P＜0.01），300 μmol/L的丙泊酚可以完全抑制動作電位的形成。結論：丙泊酚對大鼠丘腦皮層環路中的S1區神經元電壓門控鈉離子通道及動作電位具有抑制作用，可能是其誘導的全身麻醉作用的機制之一。［關鍵詞］ 丙泊酚；膜片鉗；鈉通道；動作電位；大鼠

相關研究顯示，全麻藥物通過影響大腦和脊髓關鍵區域的突觸傳遞和離子通道發揮作用［1-2］，且藥物的中樞抑制作用與各腦區之間信息的傳遞、處理、整合及分離過程密切相關［3-4］。目前對丙泊酚全麻機制的研究主要集中在其對大鼠海馬、丘腦、脊髓等的影響，對皮層神經元電生理學的作用研究報道則較少，其誘導的全身麻醉作用與皮層電壓門控離子通道是否有關尚需進一步探討。初級軀體感覺皮層（S1）是大鼠丘腦皮層環路中軀體感覺信息傳遞的關鍵腦區之一，本實驗擬使用腦片膜片鉗技術，采用全細胞記錄模式，檢測不同濃度丙泊酚對大鼠S1區錐體神經元電壓門控鈉離子通道及動作電位的影響。

1　材料和方法

1.1材料 動物：健康SD大鼠，SPF級，鼠齡7～14 d，雌雄不拘。藥品與試劑：丙泊酚（阿斯利康公司），河豚毒素（TTX，Sigma公司），人工腦脊液（ACSF）：126 NaCl，2.5 KCl，2 CaCl2，2 MgSO4· 7H2O，1.5 NaH2PO4·2H2O，25 NaHCO3，10 Glucose· H2O（mmol/L）；鈉離子通道記錄電極內液：140 CsCl，5 NaCl，1 CaCl2，10 HEPES，10 EGTA，2 MgCl2·6H2O，2 Na2-ATP（mmol/L）；動作電位記錄電極內液：120 KCl，1 CaCl2，10 HEPES，10 EGTA，2 MgCl2·6H2O，3 Na2-ATP（mmol/L）。儀器：EPC10膜片鉗放大器，德國HEKA公司；PCS-5400微電極操縱器，美國Burleigh公司；BX51W1-IR7顯微鏡，日本Olympus公司；HM 650V全自動振動式切片機，美國Thermo公司；P-97微電極拉制儀，美國Sutter公司。

1.2方法

1.2.1分組方法：設立對照組（Control組）和實驗組，Control組腦片灌流普通ACSF，實驗組腦片根據ACSF中所含丙泊酚濃度的不同分為：丙泊酚10 μmol/L（Pro10組），丙泊酚30 μmol/L（Pro30）組，丙泊酚100 μmol/L（Pro100）組及丙泊酚300 μmol/L（Pro300）組，各組腦片例數為8（n=8）。

1.2.2腦片的制備方法：健康SD大鼠乳鼠快速斷頭，快速剝出全腦置于氧混合氣（95% O2+5% CO2）飽和的0～4 ℃的ACSF中5 min。使用Thermo HM 650V全自動振動式切片機沿冠狀面制備出包含S1區厚度為300 μm的腦切片，置于腦片孵育槽中。在控制32 ℃下平衡孵育30 min，復溫30 min。

1.3統計學處理方法 采用PatchMaster軟件記錄電信號，FitMaster、SPSS 19.0、Origin7.5統計軟件進行數據提取、統計分析和圖表繪制。所得數據均用±s表示，組間比較用單因素方差分析。鈉通道的激活：利用公式G=I/（V-Vrev）將所得的鈉電流峰值轉換成電導值，以電導值與最大電導值的比值及對應膜電位繪制出各組鈉通道的穩態激活曲線。用Boltzmann方程G/Gmax=1/｛1+exp［V-V1/2］/κ｝進行擬合，式中G為電導，V為膜電位，V1/2為半數激活電壓，κ為曲線斜率因子。鈉通道的失活使用Boltzmann方程I/Imax=1/｛1+exp［V-V1/2］/κ｝進行擬合，求得半數失活電壓和曲線斜率因子。鈉通道去失活根據單指數方程I/Imax=1-exp（-t/γ）進行擬合，式中I和Imax分別為不同恢復時間的電流大小和條件脈沖誘發的電流，t為恢復時間，γ為通道恢復的時間常數。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1S1區錐體神經元電壓門控鈉離子通道電流圖

采用鈉通道的細胞外液和電極內液，全細胞記錄模式形成后，置鉗制電位于-80 mV，給予神經元一幅度-30 mV，刺激時程20 ms的去極化脈沖刺激電壓可誘發一快速激活與失活的內向電流，該電流可被1 μmol/L的鈉通道阻斷劑TTX所阻斷，證實其為TTX敏感的INa，見圖1。

圖1　TTX對大鼠S1區錐體神經元INa的阻斷作用

2.2丙泊酚對電壓門控鈉通道IV曲線的影響 置鉗制電位于-80 mV，給予脈沖幅度為-80 mV～+60 mV，脈沖寬度20 ms，步幅+10 mV的去極化脈沖刺激電壓，可激發一系列INa，見圖2。以不同膜電位為橫軸，該膜電位下的INa峰值為縱軸，繪制INa的IV曲線。丙泊酚作用穩定后，INa的IV曲線顯著上移，但INa的激活閾電位沒有明顯變化（約-60 mV），且在-30 mV能夠激發最大INa，見圖3。隨著丙泊酚濃度的升高，INa峰值呈濃度依賴性下降，見圖4。

圖2　鈉通道電流的刺激方波和記錄的電流曲線

圖3　各組電壓門控鈉通道電流IV曲線

圖4　各組對鈉通道電流峰值的抑制

2.3丙泊酚對電壓門控鈉通道激活及失活的影響

置鉗制電位于-80 mV，預置-120 mV超極化電壓500 ms，然后從-80 mV起給予10 mV步幅遞增，12 ms脈寬的去極化脈沖刺激至0 mV，記錄各組神經元INa變化，見圖5。以電導值與最大電導值的比值及對應膜電位繪制出各組鈉通道的穩態激活曲線，見圖6。INa穩態激活曲線均呈S型，與正常組曲線相比，其他各組曲線沒有明顯的移位，INa的半數激活電壓V1/2及斜率因子κ也未發生顯著變化，見表1。置鉗制電位-100 mV，先給予-100～-10 mV，步幅10 mV，刺激波寬500 ms的階梯鉗制預脈沖刺激，間隔1 ms之后，再給予-30 mV的測試脈沖刺激，刺激波寬12 ms，記錄各組測試脈沖下鈉通道電流，見圖7。以電流值與最大電流值的比值及對應膜電位繪制出各組INa的穩態失活曲線，見圖8。各組鈉通道電流穩態失活曲線均呈反S型，與正常組曲線相比，其他各組曲線向左（超極化方向）移位。丙泊酚呈濃度依賴性加快鈉通道電流的失活，使失活曲線向超級化方向移動，除Pro300組外基本上不改變曲線斜率因子。

圖5　鈉通道電流激活的刺激方波和記錄的電流曲線

圖6　各組電壓門控鈉通道電流穩態激活曲線

表1　各組INa半數激活電壓和激活斜率因子（n=8）

表1　各組INa半數激活電壓和激活斜率因子（n=8）

分組　　激活　　失活V1/2　　κ　V1/2　　κ Control-48.08±0.65 4.75±0.71　-51.07±2.14b6.73±0.26bPro10　-48.44±1.23 4.43±0.51　-52.63±1.48b6.96±0.57bPro30　-48.58±0.76 4.38±0.60　-56.52±1.39b7.16±0.73bPro100　-49.03±1.41 4.35±0.72　-61.58±1.43b7.71±0.87bPro300　-49.18±1.71 4.13±0.47　-66.92±1.78b8.70±1.19a與Control組比：aP＜0.05，bP＜0.01

2.4丙泊酚對電壓門控鈉通道去失活的影響 置鉗制電位于-80 mV，給予-10 mV的條件脈沖12 ms，然后給予-10 mV的去極化測試脈沖20 ms，兩個刺激間隔保持鉗制在-80 mV，間隔時程從2～20 ms，刺激間隔2 ms，記錄各組INa變化，見圖9。與正常組曲線相比，其他各組曲線下移，曲度逐漸減小，見圖10。各組的通道恢復時間常數隨著丙泊酚濃度增加而逐漸延長，見圖11。

圖7　鈉通道電流失活的刺激方波和記錄的電流曲線

圖8　各組電壓門控鈉通道電流穩態失活曲線

圖9　鈉通道去失活的雙脈沖刺激方波和記錄的電流曲線

2.5丙泊酚對神經元由單刺激引發的動作電位的影響 全細胞記錄模式形成后，在電流鉗模式下，給予神經元一幅度50 pA，刺激時程30 ms的去極化脈沖刺激電流，誘發動作電位發放，見圖12。300 μmol/L組的丙泊酚可以完全抑制動作電位的形成，只形成刺激電流引起的電緊張，因此Pro300組相關數據不予統計分析。結果顯示丙泊酚使神經元動作電位的幅度（超射值）呈濃度依賴性下降，除Pro100組外基本上不改變其閾值，見表2。

圖10　各組電壓門控鈉通道失活后的恢復曲線

圖11　各組電壓門控鈉通道失活后恢復的時間常數

圖12　丙泊酚對大鼠S1區神經元動作電位的影響

3　討論

全身麻醉藥物在中樞系統存在多個作用靶點，目前認為麻醉藥物通過影響神經系統中的突觸傳遞和離子通道的狀態，抑制興奮性神經元傳遞并加強抑制性神經元傳遞［5］。實驗結果表明，丙泊酚對大鼠S1區神經元電壓門控鈉通道存在抑制作用，一方面以濃度依賴性的方式抑制鈉通道電導，降低INa，另一方面通過改變通道動力學特性，加快通道的失活，延緩通道的去失活。丙泊酚雖然不影響鈉通道的激活過程，但各組丙泊酚均使鈉通道失活曲線向左移動，半數失活電壓逐漸向超級化方向變化，說明丙泊酚能促進鈉通道的失活，減少神經元細胞膜上可激活的鈉通道數量，從而減少神經沖動的產生和傳導，達到中樞抑制作用。同時，丙泊酚呈濃度依賴性延長鈉通道失活后的恢復時間，通過延緩通道失活后的恢復過程，減弱神經元對刺激的反應性，使細胞興奮性降低。這些結果表明丙泊酚可能通過作用于鈉通道的不同位點或者他們的調節器發揮其對通道的不同效應，最終產生全麻效應。

表2　各組動作電位特性（n=8，mV）

表2　各組動作電位特性（n=8，mV）

與Control組比：aP＜0.01

分組　　超射值　　閾值Control　34.87±1.17b　-42.16±0.55bPro10　29.49±0.48b　-41.79±0.66bPro30　25.56±0.56a　-41.32±0.99bPro100　10.72±0.31a　-37.93±1.30a

離子通道是生物體內信息傳遞的基本單位，是細胞興奮性的基礎。動作電位是可興奮性細胞興奮標志，是細胞生命活動的基礎。鈉通道開放引起去極化內向電流是動作電位產生和傳遞的基礎，是中樞神經系統神經元之間、各腦區間進行信息交流和調控的必要條件。本研究結果顯示丙泊酚呈濃度依賴性抑制大鼠S1區神經元動作的超射值并對電位閾值產生了一定的影響，這種抑制則是通過影響鈉通道來實現的。丙泊酚能抑制鈉通道電流，INa的強度則決定動作電位的幅值，因此動作電位的超射值隨丙泊酚濃度的增加而顯著下降。另一方面丙泊酚通過加快通道失活和對電流的抑制共同影響動作電位的去極化。動作電位的傳導速度和幅度與鈉通道的功能狀態和鈉離子驅動力等因素有關，丙泊酚可改變動作電位的傳導特性并使神經元興奮性下降。

目前的神經生物學理論認為，意識的產生是大范圍、各層次的腦神經共同參與的結果，包括皮層、丘腦和中腦（主要為腦干網狀結構上行激活系統）在內的各腦區必須共同參與對外界信號刺激的識別和處理，而最終產生意識。感覺信息的處理加工在意識的形成過程中起著至關重要的作用［6］，各種感覺信息需要經過腦干的相應核團傳輸到丘腦腹側基底復合體，然后傳遞到初級感覺皮質區，最后擴散到鄰近的感覺聯合皮質區及額葉聯合皮質［7］。中樞整體整合的觀點認為意識覺醒的狀態與整個中樞神經系統信號轉導網絡整合活動有關［8］。全麻藥物對這種整合活動的抑制或阻斷可能最終導致了意識的消失。整個神經系統內部存在著神經元之間、各腦區間復雜的信息交流方式，提示藥物的作用位點應該是多水平、多方面的，任何單一的位點或作用機制不能解釋麻醉的整體效應［9］。本研究顯示丙泊酚對皮層神經元電壓門控鈉通道及動作電位存在抑制作用，該抑制效應可能通過傳入、傳出神經纖維各種方式的級聯、整合而影響相關的腦區，發揮更廣泛的中樞效應。

綜上所述，丙泊酚對大鼠丘腦皮層環路中的S1區神經元電壓門控鈉離子通道及動作電位具有抑制作用，可能是其誘導的全身麻醉作用的機制之一。

［1］Kopp Lugli A， Yost CS， Kindler CH. Anaesthetic mechanisms: update on the challenge of unravelling the mystery of anaesthesia［J］. Eur J Anaesthesiol， 2009， 26（10）: 807-820.

［2］Nau C. Voltage-gated ion channels［J］. Handb Exp Pharmacol， 2008， 182（1）: 85-92.

［3］Alkire MT， Hudetz AG， Tononi G. Consciousness and anesthesia［J］. Science， 2008， 322（5903）: 876-880.

［4］Barrett AB， Murphy M， Bruno MA， et al. Granger causality analysis of steady-state electroencephalographic signals during propofol-induced anaesthesia［J］. PLoS One， 2012，7（1）: e29072.

［5］Lingamaneni R， Hemmings HC Jr. Differential interaction of anaesthetics and antiepileptic drugs with neuronal Na+channels， Ca2+channels， and GABAA receptors［J］. Br J Anaesth， 2003， 90（2）: 199-211.

［6］Varela F， Lachaux JP， Rodriguez E， et al. The brainweb: phase synchronization and large-scale integration［J］. Nat Rev Neurosci， 2001， 2（4）: 229-239.

［7］Kimura A， Yokoi I， Imbe H， et a1. Auditory thalamic reticular nucleus of the rat: anatomicaI nodes for modulation of auditory and cross-modal sensory processing in the loop connectivity between the cortex and thalamus［J］. J Comp Neurol， 2012， 520（7）: 1457-1480.

［8］曹云飛， 俞衛鋒， 王士雷. 全麻原理及研究新進展［M］. 北京：人民軍醫出版社， 2005： 329.

［9］Pittson S， Himmel AM， Maclver MB. Multiple synapitic and membrane sites of anesthetic action in the CA1 region of rat hippocampal slices［J］. BMC Neurosci， 2004， 5: 52.

（本文編輯：吳彬）

Effects of propofol on voltage-gated sodium channels and single action potention of S1 neurons in rats

HE Jiongce1， ZHANG Yu2， LIU Xingkui2， YU Tian2. 1.Department of Anesthesia， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027； 2.Department of Anaesthesiology， Zunyi Medical College，Zunyi， 563003

Objective: The aim of this study is to investigate the effects of propofol on voltage-gated sodium channels and single action potention （AP） of primary S1 neurons in rats. Methods: Brain slices were prepared from SD rats of 7 to 14 days old， and whole-cell patch clamp technique was used to record currents and voltages. After application with propofol at different concentrations （10-300 μmol/L）， the sodium currents （INa） were recorded. Data were used to make current-voltage curve， steady-state activation curve， steady-state inactivation curve，deinactivation curve and account characteristic parameters. AP was activated by a 30 mspulse of 50 pA， the data of each group were taken for analysis. Results: Propofol inhibited INA of S1 neurons in rats in a dose-dependent manner （10-300 μmol/L）. It also inhibited the inactivation of sodium channels， shifted the inactivation curve towards the hyperpolarzating potential， and prolonged the recovery of sodium channels from their deinactivation，however it did not affect activation of sodium channels. Propofol inhibited the overshoot of single AP of S1 neurons in rats in a dose-dependent manner （10-100 μmol/L， P＜0.01）， and also depressed the overshoot （100 μmol/L，P＜0.01）， there was no AP be activated at 300 μmol/L. Conclusion: Propofol shows an inhibitory effect on voltage-gated sodium channels and AP of S1 neurons in the thalamocortical circuit， which may play a role in the mechanisms of propofol-induced general anesthesia.

propofol； patch clamp； sodium channel； action potention； rats

R614.1

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.12.001

2015-04-22

國家自然科學基金資助項目（81060266）。

何炯策（1986-），男，浙江溫州人，住院醫師，碩士。

劉興奎，教授，Email：xkliu@zmc.edu.cn。