玉米麩皮多糖對人結腸癌HT-29細胞增殖的抑制作用

徐偉麗，崔鵬舉，魯兆新，張蘭威

(哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，150090哈爾濱)

玉米生產加工過程中會產生大量的副產物玉米麩皮，其得率約為玉米原料量的10%～15%.因此，由玉米麩皮制備的多糖備受關注.目前，對于玉米麩皮多糖的研究主要集中于制備方法、降血糖、減肥降脂、抗便秘作用等［1-4］.有研究表明玉米皮多糖還可作為治療結腸癌的輔助手段［1］，但是還不清楚其確切的分子機制.本研究探討了玉米麩皮多糖體外對結腸癌HT-29細胞的抑制作用，為進行下一步的機制研究提供實驗依據，為開發腫瘤化學預防劑和保健食品的新資源奠定了理論基礎.同時，促進了玉米加工副產物的深度開發利用，對于合理利用糧食資源、全面提高玉米加工產業的社會及經濟效益有重要意義.

1 實驗

1.1 實驗材料

人結腸癌HT-29細胞購自協和醫科大學基礎所細胞中心.玉米麩皮多糖:以玉米麩皮為原料，采用超臨界方法去除玉米麩皮中的油脂，采用淀粉酶、蛋白酶去除玉米麩皮中的淀粉、蛋白質.以水為提取溶劑，提取玉米麩皮多糖，濾液低溫減壓濃縮，醇沉，得水提玉米麩皮多糖.以水提后的水不溶物為原料，分別采用堿液和堿性過氧化氫溶液為提取劑，中和濾液，低溫減壓濃縮，醇沉，得堿提玉米麩皮多糖和堿性H2O2提玉米麩皮多糖.

1.2 實驗試劑

四氮唑藍(MTT)、RNA 酶、HEPES、DMSO、丙烯酰胺(Sigma Aldrich，美國);L-谷氨酰胺(原平皓公司，中國);RPMI 1640培養基、小牛血清(Gibco公司，美國);Giemsa Stain(Amresco，美國);其余試劑均為分析純.

1.3 實驗儀器

Labo AutoCLAve高壓滅菌器、Program Oven干熱滅菌箱，日本SANYO公司;IX70倒置顯微鏡，日本Olympus公司;ELX800酶標儀，Bio-Tek公司;MODEL 5410 CO2培養箱，NAPCO公司.

1.4 細胞培養和處理

HT-29細胞在含有1%谷氨酰胺、10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養液中，于37℃、5%的CO2培養箱中常規培養，用0.02%EDTA/0.25%胰酶消化后進行傳代，取對數增殖期的細胞用于實驗.

對3種方法得到的玉米麩皮粗多糖(水提、堿提和堿性H2O2提玉米麩皮多糖)進行體外抗腫瘤作用研究.將多糖用改良型RPMI-1640培養液分別配制成10 g/L的溶液，0.22 μm濾膜過濾除菌，密封并于-20℃下保存，備用，使用時用培養基稀釋到所需質量濃度.根據預實驗結果確定用于培養人結腸癌HT-29細胞的水提玉米麩皮多糖為 0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.10 g/L 6個劑量組，堿提和堿性H2O2提玉米麩皮多糖為0.02，0.10，0.50，2.50，10.00 g/L 5 個劑量組，腫瘤細胞加培養液為對照組.

1.5 細胞毒性檢測

細胞毒性參考文獻［5］進行檢測.取對數生長期HT-29細胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液制成2.5×104mL-1的單細胞懸液，接種于96孔板中，每孔5×103個細胞.另設對照組.置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后，換成含不同質量濃度玉米麩皮多糖的培養液，從加藥第1天起，每天各取1塊96孔板進行MTT檢測，連續2 d，測出OD值.檢測玉米麩皮多糖對HT-29細胞生長的抑制情況及IC50.

1.6 細胞形態學觀察

將細胞接種于培養瓶中，待細胞貼壁并達40%以上融合時，分別更換含有不同質量濃度玉米麩皮多糖的培養液，繼續培養指定的時間.在Olympus相差倒置顯微鏡下觀察細胞的形態變化，并進行拍照.

1.7 細胞核分裂指數

細胞核分裂指數參考文獻［5］進行檢測.將HT-29細胞接種于24孔培養板內，每孔1.0×104個細胞，每個劑量4個平行孔.細胞貼壁后，更換含不同質量濃度玉米麩皮多糖的無血清培養液，分別培養24，48 h后，75%乙醇固定，Giemsa染色(稱Giemsa粉末0.5 g，加幾滴甘油研磨，再加入甘油33 mL.56℃保溫90～120 min.加入33 mL甲醇，置棕色瓶中保存，此為Giemsa原液.按要求用PBS稀釋10倍使用).計數1 000個細胞中所含分裂相的細胞數，求出分裂指數，并與對照組比較，計算抑制率.

分裂指數=分裂細胞數/細胞總數×100%;抑制率=(1-給藥組分裂指數/對照組分裂指

數)×100%.

1.8 集落形成實驗

集落形成實驗參考文獻［5］進行.常規培養細胞，將HT-29細胞接種于24孔培養板內，每孔200個細胞，每組4個平行孔.培養24 h后更換含不同質量濃度玉米麩皮多糖的培養液，再分別培養24和48 h后，換正常培養液繼續培養10 d，甲醇固定，Giemsa染色，鏡下計數每孔＞50個細胞以上的集落數目，按下式計算:

集落形成率(%)=(每皿集落數/每皿接種細胞數)×100;

集落形成抑制率(%)=(1-加藥組集落形成率/對照組集落形成率)×100.

1.9 統計分析

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，組間差異采用方差分析進行處理，P＜0.05表示差異具有統計學意義.

2 實驗結果

2.1 玉米麩皮多糖對HT-29細胞的毒性作用

采用不同質量濃度的玉米麩皮多糖處理HT-29細胞24和48 h，結果如圖1～3所示.隨著水提玉米麩皮多糖質量濃度的增加和作用時間的延長，HT-29細胞的存活率呈下降趨勢(圖1).0.01 g/L的水提玉米麩皮多糖處理24 h，HT-29細胞的抑制率為6.9%，0.02 g/L的水提玉米麩皮多糖作用24和48 h對HT-29細胞抑制率分別為33.1%和60.6%，24 h的IC50值為0.053 g/L，48 h的IC50值為0.038 g/L.其他兩種多糖處理24和48 h對HT-29細胞的毒性作用不顯著(圖2，3).

圖1 水提玉米麩皮多糖對HT-29細胞存活的影響(x±s，n＝5)

圖2 堿提玉米麩皮多糖對HT-29細胞存活的影響(x±s，n＝5)

圖3 堿性H2O2提玉米麩皮多糖對HT-29細胞存活的影響(x±s，n＝5)

2.2 細胞形態觀察結果

采用倒置顯微鏡觀察不同方法獲得的多糖對細胞形態的影響，結果如圖4～6所示.對照組細胞形態正常，細胞呈菱形或不規則形，細胞體積大，生長緊密，細胞間隙小(圖4(a));經過水提玉米麩皮多糖處理后，細胞體積和密度逐漸變小，附壁疏松、變圓.隨著多糖處理時間的延長和質量濃度的增大，細胞貼壁能力明顯下降，脫落增加，飄浮于培養液中，細胞破裂、壞死增多.在低質量濃度下(0.02 g/L)處理HT-29細胞96 h，細胞克隆形態多樣，多數呈團塊狀、島狀或巢狀，隨時間的延長愈明顯(圖4(b)～(d)).堿提玉米麩皮多糖和堿性H2O2提玉米麩皮多糖 對HT-29細胞的抑制作用不明顯，10 g/L處理96 h才表現出抑制作用，細胞形態略有變化(圖5(f)和圖6(f)).根據MTT實驗和形態學觀察結果，后面實驗僅對水提玉米麩皮多糖進行檢測.

圖4 水提玉米麩皮多糖對HT-29細胞生長形態的影響(100×)

2.3 細胞核分裂指數結果

細胞核分裂指數結果見表1，不同質量濃度的水提玉米麩皮多糖處理24和48 h抑制率分別為9.0%～41.0%和19.8%～67.9%.隨著劑量的增加和時間的延長，水提玉米麩皮多糖對細胞有絲分裂的抑制作用增強.

2.4 細胞的集落形成結果

細胞的集落形成結果見表2.水提玉米麩皮多糖各劑量組與對照組相比，對結腸癌HT-29細胞集落形成均有抑制作用，且隨劑量的增加抑制作用增強.0.1 g/L的水提玉米麩皮多糖作用48 h，集落形成抑制率達88.1%.該結果顯示水提玉米麩皮多糖能夠有效抑制HT-29細胞的集落形成.

圖5 堿提玉米麩皮多糖對HT-29細胞生長形態的影響(100×)

圖6 堿性H2O2提玉米麩皮多糖對HT-29細胞生長形態的影響(100×)

表1 水提玉米麩皮多糖處理對HT-29細胞分裂指數的影響±s，n＝4)

表1 水提玉米麩皮多糖處理對HT-29細胞分裂指數的影響±s，n＝4)

* P＜0.05與對照組相比.

組別/(g·L-1)癌細胞有絲分裂數24 h 48 h分裂指數/%24 h 48 h抑制率 /%24 h 48 h對照 556.0±4.7 786.0±3.8 27.8 39.3 — —0.01 506.1±3.2 630.0±4.1 25.3 31.5 9.0 19.8 0.02 434.2±2.7 366.0±3.4* 21.7 18.3 21.9 53.4 0.10 328.0±3.1* 252.3±2.2* 16.4 12.6 41.0 67.9

表2 水提玉米麩皮多糖處理對HT-29細胞集落形成能力的影響±s，n＝4)

表2 水提玉米麩皮多糖處理對HT-29細胞集落形成能力的影響±s，n＝4)

* P＜0.05與對照組相比.

組別/(g·L-1)集落數/孔24 h 48 h集落形成率/%24 h 48 h抑制率/%24 h 48 h對照 28.5±4.0 29.6±3.3 15.1 15.9 — —0.01 22.0±3.1 18.1±2.1* 11.5 10.1 23.8 36.5 0.02 13.1±2.6* 9.7±1.1* 8.6 6.9 43.0 56.6 0.10 7.6±1.9* 4.6±1.3* 3.1 1.9 79.5 88.1

3 討 論

流行病學統計表明［6-7］:全谷物食品中的多糖可以保護機體免受自由基的傷害，還可抵抗一些慢性疾病，如冠心病、糖尿病和癌癥等.大多數動物實驗和流行病學資料也表明，高纖維膳食可明顯降低結腸癌的發病率［8］.各種來源的纖維素都具有預防結腸癌的作用，半纖維素也有抗癌作用，但由于成分較復雜，目前對其單一成分的研究報道不多.玉米多糖包括玉米麩皮、玉米子粒、玉米須和玉米花粉多糖.玉米麩皮多糖因其制備原料豐富而備受關注，可將其作為保健食品或保健食品原料使用［9］.

目前，關于玉米麩皮多糖的研究主要集中在提取［10-11］、純化［12-14］、化學結構［14-16］及生理活性.國內外的研究已證實玉米麩皮多糖具有抑制肝損傷、減肥降脂、抗便秘及降血糖等生物活性［1-4］.迄今為止，關于玉米麩皮多糖對腫瘤的抑制作用及其機制的研究均未見報道.

前期實驗結果表明，水提玉米麩皮多糖具有良好的抗氧化活性，在一定質量濃度范圍內，抗氧化性與質量濃度呈正相關;本研究中MTT實驗表明，水提玉米麩皮多糖的抗增殖作用與質量濃度呈正相關，堿提法和堿性H2O2法提取的玉米麩皮多糖對HT-29細胞的毒性作用不明顯.HT-29細胞經不同質量濃度(0，0.02，0.1，0.5，2.5 和10 g/L)的水提玉米麩皮多糖處理后，細胞生長緩慢，附壁疏松、變圓，細胞體積減小;經0.1 g/L以及高于此質量濃度的多糖處理后的HT-29細胞，鏡下觀察發現細胞脫落增加，飄浮于培養液中，細胞破裂、壞死增多.細胞發生這一系列變化可能與玉米麩皮多糖作用腫瘤細胞后，引起腫瘤細胞的細胞器和細胞膜的變化，如線粒體腫脹、糖原合成分泌增加有關.同時，水提玉米麩皮多糖能夠抑制HT-29細胞有絲分裂數和集落形成率，并呈時間和劑量效應.綜上，在抗氧化性和抗腫瘤作用方面水提玉米麩皮多糖均優于堿提法和堿性H2O2法提取的玉米麩皮多糖，這可能是由于在采用堿和/或堿性H2O2提取的過程中，多糖的某些功能部分的活性喪失或減弱，因此，擬采用水提玉米皮多糖進行后續實驗.本研究為下一步對水提玉米麩皮多糖抑制HT-29細胞生長作用機理的研究奠定了實驗基礎.

［1］DAIZO A，EGASHIRA Y，SANADA H.Suppressive effect of corn bran hemicellulose on liver injury induced by D-galactosamine in rats［J］.Nutrition，2005，21(10):1044-51.

［2］張艷榮，劉婷婷，王大為.玉米活性多糖減肥降脂作用的研究［J］.食品科學，2006，27(5):227-230.

［3］張艷榮，張雁南，王大為.玉米皮活性多糖的抗便秘作用［J］.吉林大學學報:醫學版，2005，31(4):509-511.

［4］張艷榮，陳麗娜，王大為.玉米活性多糖對糖尿病小鼠的降血糖作用［J］.吉林大學學報:醫學版，2005，31(6):846-848.

［5］XU Weili，LIU Jiaren，LIU Huikun，et al.Inhibition of proliferation and induction of apoptosis by γ-tocotrienol in human colon carcinoma HT-29 cells［J］.Nutrition，2009，25(5):555-566.

［6］DECKER E，BEECHER G，SLAVIN J.Whole grains as a source of antioxidants ［J］.Cereal Foods World，2002，47(8):370-373.

［7］GOODLAD R A，ENGLYST H N.Redefining dietary fibre:potentially a recipe for disaster ［J］.Lancet，2001，358:1833-1834.

［8］LUP T J.Is fibre protective agaist colon cancer?Where the research is leading us［J］.Nutrition，2000，16:558-561.

［9］CLEMENS R.Redefining fiber［J］.Food Technology，2001，55(2):100-101.

［10］BENKO Z，ANDERSSON A，SZENGYEL Z，et al.Heat extraction of corn fiber hemicellulose［J］.Appl Biochem Biotechnol，2007，137-140(1-12):253-265.

［11］LEATHERS T D，NUNNALLY M S，PRICE N P.Price co-production of schizophyllan and arabinoxylan from corn fiber［J］.Biotechnol Lett，2006，28(9):623-626.

［12］YADAV M P，PARRIS N，JOHNSTON D B，et al.Fractionation， characterization， and study of the emulsifying properties of corn fiber Gum ［J］.J Agric Food Chem，2008，56(11):4181-4187.

［13］ALLERDINGS E，RALPH J，STEINHART H，et al.Isolation and structural identification of complex feruloylated heteroxylan side-chains from maize bran［J］.Phytochemistry，2006，67(12):1276-1286.

［14］張艷榮，劉相陽，于君，等.玉米皮多糖的組成及結構［J］.食品科學，2011，32(3):64-67.

［15］蘆菲，李波，李春陽，等.玉米皮多糖的制備方法及結構研究［J］.安徽農業科學，2008，36(17):7445-7446，7495.

［16］SAULNIER L，CREPEAU M J，LAHAYE M，et al.Isolation and structural determination of two 5，5＇-diferuloyl oligosaccharides indicate that maize heteroxylans are covalently cross-linked by oxidatively coupled ferulates［J］.Carbohydrate Research，1999，320(1):82-92.