丁苯酞對腦缺血再灌注大鼠神經細胞超微結構及細胞凋亡的影響

張曉璇 邱海鵬

河北承德附屬醫院神經內科 承德 067000

近年來，缺血性腦卒中的發病率越來越高，嚴重威脅著人類的健康，腦缺血再灌注損傷對該類疾病的預后具有較大的影響，細胞凋亡是腦缺血再灌注損傷的主要病理基礎。丁苯酞（dl－3n－butylphthalide，NBP）對缺血性腦卒中具有較好的臨床效果，能從多條途徑改善患者的臨床癥狀。bcl－2、bax和caspase－3對細胞凋亡具有重要的調控作用，可導致蛋白酶級聯反應的發生而引起凋亡［1－2］。筆者通過造腦缺血再灌注損傷模型，探討丁苯酞對腦缺血再灌注大鼠神經細胞超微結構及細胞凋亡因子bcl－2、bax和caspase－3表達的影響，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 動物和處理SD 雄性大鼠共108 只，體質量（250±20）g，購置于南京市江寧區青龍山動物繁殖場，隨機分為假手術組、模型組和丁苯酞組，丁苯酞組，每組36只，大鼠在造模前3d以80mg／（kg·d）的劑量給予丁苯酞，其他組大鼠給予同劑量的生理鹽水。使用大腦中動脈內線栓阻斷法制造腦缺血再灌注模型，造模成功2h后拔除線栓，再灌注24 h。每組使用12只用于神經細胞超微結構的觀察，12只用于TUNEL法檢測細胞凋亡，12只用于bcl－2、bax和caspase－3表達的檢測。

1.2 神經細胞超微結構、凋亡細胞和免疫組化處理缺血2h再灌注24h后麻醉并開胸，右心耳放血并使用生理鹽水灌流，最后用多聚甲醛灌注固定，取腦組織，制作石蠟切片，蘇木精－伊紅染色，使用透射電鏡觀察神經細胞超微結構。并使用TUNEL染色觀察凋亡細胞，凋亡細胞特征：濃聚并集聚的核染色質，有凋亡小體存在；使用SpectrumSee醫學圖像分析系統對凋亡細胞和總細胞進行計數，凋亡細胞指數（AI）＝［（凋 亡 細 胞 數／總 細 胞 數）100%］。bcl－2、bax 和caspase－3免疫組化試劑盒購置于上海美軒生物科技有限公司，陽性細胞判斷：bcl－2胞漿和胞膜呈棕黃色著色；bax胞漿呈棕黃色著色；caspase－3細胞質、胞核呈棕黃色著色。使用BandScan圖像分析軟件計算各免疫組化結果的積分光密度值。

1.3 統計學分析實驗數據使用SPSS 19.0軟件處理，計量資料以均數±標準差±s）表示，行t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組腦細胞超微結構的差異假手術組：規則的細胞形狀，胞質內可見豐富的圓形或棒槌形線粒體，有較整齊的內嵴，且清晰呈現，無空泡變性，散在分布有粗面內質網，密集的核糖體依附其上，核規則且圓，有完整的核膜，有明顯的核仁，染色質均勻，具有較高的電子透明度。模型組：不規則的細胞外形，線粒體內嵴出現斷裂、減少、甚至消失，有大量空泡存在，粗面內質網上的核糖體出現較多的脫落，胞質內存在高電子密度顆粒，核膜發生崩解，染色質聚集且靠邊。丁苯酞組：腦細胞超微結構損傷輕于模型組，大部分線粒體膜較完整，空泡少，內質網形態較正常，高電子密度顆粒較少，染色質出現輕度聚集，核仁可見。

2.2 各組腦組織凋亡細胞指數的差異假手術組、丁苯酞組和模型組凋亡細胞指數依次升高，各組間相互比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組腦組織凋亡細胞指數的差異 ±s）

表1 各組腦組織凋亡細胞指數的差異 ±s）

注：與模型組比較，t＝34.957，＊P＝0.000；與丁苯酞組比較，t＝25.602，＃P＝0.000；與丁苯酞組比較，t＝11.351，＆P＝0.000

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2.3 各 組 腦 組 織bcl－2、bax 和caspase－3 的 差 異假 手 術組、丁苯酞組和模型組bax和caspase－3依次升高，各組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）；假手術組、模型組和丁苯酞組bcl－2 依次升高，各組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組腦組織bcl－2、bax和caspase－3積分光密度值比較 ±s）

表2 各組腦組織bcl－2、bax和caspase－3積分光密度值比較 ±s）

注：與模型組比較，t＝15.775、10.384、23.745，aP＝0.000、0.000、0.000；與 丁 苯 酞 組 比 較，t ＝19.805、6.679、16.437，b P＝0.000、0.000、0.000；與 丁 苯 酞 組 比 較，t＝5.502、3.456、8.333，c P＝0.000、0.001、0.000

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3 討論

缺血性腦血管疾?。╥schemic cerebral vascular disease，ICVD）急性期的血液存在中斷，神經細胞在缺血缺氧的環境中，導致細胞的能量代謝發生異常，及時恢復缺血腦區的血液供應對該類疾病的治療極為重要，但腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）對患者的預后也存在巨大的影響，如何預防缺血性腦血管疾病腦缺血再灌注損傷的發生成為該類疾病研究的新重點［3］。神經元凋亡對腦缺血再灌注損傷的程度具有較大的影響，防止細胞凋亡成為減少缺血再灌注損傷的關鍵。

凋亡相關蛋白含量的變化在細胞凋亡過程中發揮重要作用。Bcl－2是一類膜整合蛋白，存在于線粒體、內質網等細胞器膜上，其對細胞凋亡具有較強的抑制作用，其在缺血過程中表達增加，但時間超過24h后其表達逐漸降低，其濃度的升高可對神經細胞形成保護作用［4］。bax蛋白是一類促凋亡蛋白質，存在于胞內膜、胞漿和細胞核，具有促進細胞凋亡的作用，其通過形成二聚體而發揮調節作用，其含量增加可增加線粒體的通透性，導致細胞色素C 釋放入胞增多，引發細胞凋亡［5］。Caspase－3是白介素－1轉換酶家族中的一員，是一類半胱氨酸蛋白酶，其可以和天冬氨酸殘基發生結合并進行剪切，其是調控細胞凋亡的重要執行者和關鍵蛋白酶［6］。正常情況下，Caspase－3是以無活性的狀態下存在的，凋亡信號可使Caspase－3激活，形成了細胞凋亡的級聯反應，形成凋亡底物。Caspase－3的存在是細胞凋亡的必經之路，對DNA 裂解修復功能具有重要影響。

丁苯酞是一類消旋體，在芹菜籽中存在其左旋體。丁苯酞可改變腦血流動力學，促進缺血區腦組織的血供，對腦組織的微循環具有改善作用［7］。丁苯酞對腦缺血期線粒體膜流動性具有調節作用，能穩定線粒體膜電位，改善神經細胞的能量代謝，對自由基的生成也有抑制作用［8］。

本研究中，丁苯酞組腦細胞超微結構損傷輕于模型組，大部分線粒體膜較完整，空泡少，內質網形態較正常，高電子密度顆粒較少，染色質出現輕度聚集，核仁可見，假手術組、丁苯酞組和模型組凋亡細胞指數依次升高（P＜0.05），說明丁苯酞能穩定缺血再灌注大鼠神經細胞的形態，抑制細胞凋亡的發生。假手術組、丁苯酞組和模型組bax 和caspase－3依次升高（P＜0.05），假手術組、模型組和丁苯酞組bcl－2依次升高（P＜0.05），說 明 丁 苯 酞 能 降 低bax 和caspase－3 水平，增加bcl－2水平，抑制細胞凋亡的發生。焦東亮等［9］研究認為，丁苯肽對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有保護作用，其作用機制可能與抑制caspase－3 表達相關。李國前等［10］研究認為，丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用，其機制可能與上調Bcl－2 的表達、下調Bax的表達有關。蔣亮亮等［11］研究認為，丁苯酞對在體外模擬腦缺血再灌注誘導的神經元損傷中的保護作用可能與其抑制Caspasce－3表達，下調bax／bcl－2比值有關。

綜上所述，丁苯酞能穩定腦缺血再灌注大鼠神經細胞超微結構，使細胞凋亡減少，其發揮藥效可能是通過增加bcl－2的表達，降低bax和caspase－3水平實現調節。

［1］ 李延可，劉寧，谷有全，等.丁苯酞對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦程序性凋亡因子－5表達的影響［J］.中國實用神經疾病雜志，2012，15（10）：6－9.

［2］ 陳曉春.丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注神經元形態和BaxmRNA 表達變化的影響［J］.江西醫學院學報，2009，49（2）：10－12.

［3］ 張培蕾，魯海濤，朱悅奇，等.丁苯酞對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用［J］.介入放射學雜志，2012，21（3）：239－242.

［4］ 李其富，陳志斌，王淑榮，等.丁基苯酞對大鼠腦缺血再灌注損傷后Bcl－2表達的影響［J］.華西藥學雜志，2011，26（4）：325－327.

［5］ Wang YG，Li Y，Wang CY，et al.L－3－n－butylphthalide protects rats＇cardiomyocytes from ischaemia／reperfusion－induced apoptosis by affecting the mitochondrial apoptosis pathway［J］.Acta Physiol，2014，210（3）：524－533.

［6］ 周小琳，于首元.丁苯肽軟膠囊對大鼠局灶性腦缺血后梗死體積和神經元凋亡相關蛋白bcl－2，caspass－3表達的影響［J］.中風與神經疾病雜志，2009，26（5）：590－591.

［7］ 陳曉春，侯文利，劉星亮.丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注神經元形態和Caspase－9mRNA 表達的影響［J］.西部醫學，2009，21（8）：1 270－1 272.

［8］ Li J，Li Y，Ogle M，et al.DL－3－n－Butylphthalide prevents neuronal cell death after focal cerebral ischemia in mice via the JNK pathway［J］.Brain Res，2010，1359：216－226.

［9］ 焦東亮，倪秀石，高艷，等.丁苯酞對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后caspase－3表達的影響［J］.中國臨床神經科學，2007，15（1）：19－23.

［10］ 李國前，王杰華，楊小霞，等.丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注損傷后凋亡相關因子表達的影響［J］.中國臨床藥理學雜志，2011，27（9）：682－685.

［11］ 蔣亮亮，張鏞，瑞霞，等.左旋丁基苯酞在體外模擬腦缺血再灌注誘導的神經元損傷中的保護作用［J］.山東醫藥，2008，48（22）：3－5.