豐富環境對快速衰老小鼠行為及一氧化氮合成酶表達的影響

吳曉強 王琰萍 余 波 官俏兵 張曉玲

浙江嘉興市第二醫院神經內科 嘉興 314000

豐富環境（environmental enrichment，EE）是與阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的社會心理治療相對應的基礎研究，通常指更大的活動空間、更多的個體間交往，以及所接觸環境的多變性和新穎性［1］。快速衰老小鼠（SAM）是一種不同于家族性AD 的轉基因模型小鼠，其與散發性AD 發病機制相關的Aβ沉積、tau蛋白的過磷酸化和氧化應激的一種自然突變的模型［2］。由日本京都大學胸病研究所Takeda［3］等通過對AKR／J系小鼠進行選擇性地近交繁育而成。本研究探討豐富環境可通過調節一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）的表達實現對SAMP 小鼠加速衰老期的學習記憶的改善。

1 材料與方法

1．1 實驗動物及環境要求 3月齡清潔級雄性SAMP8小鼠24只（購自北京維通利華實驗動物有限公司）。小鼠被安置于室內光照遵循12h明暗周期（07：00開燈，19：00熄燈）、恒定室內溫度于20～22 ℃、濕度為（55±5）%的環境飼養4周，以熟悉周圍。4 月齡SAMP8 小鼠［4-5］，采用數字 表分組法隨機分成標準環境組（standard environment，SE）和豐富環境組（enrichmental environment，EE）。并淘汰不合格者（外部腫瘤、運動能力受限等，共4只）SE 組9只小鼠，SE 為長×寬×高為48．5cm×35cm×20cm 的無毒聚乙烯鼠盒，上為一不銹鋼絲籠蓋，籠底為無毒無味的的樹木刨花墊料。EE組11只小鼠，EE為大小、質地與標準籠相同，內設有：組合式長隧道一套、爬梯1個，跑籠2個，數個顏色形狀不同的道具，每日更換道具位置。

1．2 Morris水迷宮試驗 直徑120cm、高50cm 的圓形塑料水池，被等分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個象限，4個象限分別標有三角形、正方形、菱形、圓形作為入水點。直徑10cm 的黑色平臺置于水池的第四象限低于水面0．5～0．8cm，位置不變，用無毒染劑將池水染成黑色，水溫控制在（21±2）℃。

定位航行實驗：第1天動物在水池中自由泳以排除因運動障礙和焦慮無法完成游泳者。第2～4天進行，每日分別從Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個象限的入水點，將每只小鼠面朝向池壁入水，同時開始計時小鼠找到平臺并爬上平臺所需的時間即逃避潛伏期。如小鼠在規定的時間內（90s）找不到平臺，則由實驗者將其引向平臺，休息15～20s后，進行下一輪實驗。

1．3 開放場試驗 開放場大小：長×寬×高為60cm×60 cm×40cm 的圓形黑色活動箱，頂端為60 W 冷光燈，每次實驗將小鼠從某一固定位置放入場地，并記錄小鼠的爬格數、直立數、理毛次數和糞便顆粒數。記錄時間為10min。每測試完一只小鼠，用蘸酒精的毛巾仔細擦拭，清除小鼠排泄物，以免影響下只小鼠的檢測。

1．4 組織準備和NOS蛋白水平的檢測 6月齡SAMP8小鼠斷頭取腦，分離海馬，-70 ℃保存。腦組織混合5×總蛋白提取液（UBIO 公司）研磨后離心10min，取上清液，BCA 法蛋白濃度定量試劑盒（UBIO 公司）蛋白濃度檢測，10%SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白質并轉移到PVDF 膜，含5%脫脂牛奶Tis緩沖液封閉3h，分別用神經元型一氧化氮合成酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）、內皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、誘導型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）一抗（CST公司）和β-actin一抗（SantaCruz公司）孵育過夜，二抗（SantaCruz公司）孵育2h，ECL 發光試劑盒（UBIO 公司）檢測NOS的表達。

1．5 NOS的mRNA 表達的檢測（Real-time PCR） 組織分離同上，使用Trizol試劑盒（Initrogen公司）提取SAMP8小鼠海馬的總RNA。應用Takara公司cDNA 合成試劑盒和3種NOS的cDNA。PCR 引物見表1。

表1 PCR 引物

1．6 統計學分析 采用SPSS 13．0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組均數比較采用Student’st檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 豐富環境對SAMP8鼠的行為學影響 Morris水迷宮試驗前1d所有小鼠自由游泳以排除運動缺陷者，連續3d定位航行實驗中，EE 組在潛伏期（tday2＝4．15，P＜0．01；tday3＝4．42，P＜0．01；tday4＝4．06，P＜0．01）與游泳路程（tday2＝8．74，P＜0．01；tday3＝10．02，P＜0．01；tday4＝9．22，P＜0．01）均較SE 組明顯下降，差異有統計學意義（P＜0．05）。2 組平均速度比較差異無統計學意義（均P＞0．05）。見表2和表3。

為排除焦慮因素干擾SAMP8鼠在Morris水迷宮試驗結果，進行了10min開放場試驗，在直立次數上EE 組與SE組比較差異有統計學意義（t＝3．93，P＜0．01），而穿格數、理毛次數及糞便顆粒數比較差異均無統計學意義（P＞0．05）。見表4。

2．2 豐富環境對SAMP8鼠的一氧化氮合成酶表達的影響 在SAMP8鼠海馬區，SE組的nNOS、eNOS蛋白表達水平均較EE組下降（t＝5．42，P＜0．01；t＝3．83，P＜0．01），但iNOS蛋白表達水平2組差異無統計學意義（P＞0．05）。見圖1。

圖1 SAMP8鼠海馬區一氧化氮合成酶表達比較

表2 2組Morris水迷宮潛伏期比較 （±s，s）

表2 2組Morris水迷宮潛伏期比較 （±s，s）

注：與EE組比較，＊P＜0．01

組別 n 第2天 第3天 第4天SE 9 86．57±6．97＊ 78．93±7．17＊ 75．90±5．05＊EE 11 74．92±4．82 66．51±3．53 67．57±5．14

表3 2組Morris水迷宮中SAMP8路程比較 （±s，mm）

表3 2組Morris水迷宮中SAMP8路程比較 （±s，mm）

注：與EE組比較，＊P＜0．01

組別 n 第2天 第3天 第4天SE 9 5 132．4±480．50＊ 4 754．87±635．10＊4 331．00±483．18＊EE 11 3 778．77±441．29 3 146．00±299．08 2 929．20±349．30

表4 SAMP8小鼠在開放場試驗中行為指標比較 （±s）

表4 SAMP8小鼠在開放場試驗中行為指標比較 （±s）

注：與SE組比較，＊P＜0．01

組別 n 直立次數 糞便顆粒數 理毛次數 穿格次數SE 9 18．22±2．90 3．44±0．56 2．11±0．42 77．50±4．83 EE 11 33．18±5．32＊2．91±0．51 2．82±0．57 91．85±9．65

同組SAMP8鼠對側海馬區，EE 組eNOS的mRNA 表達較SE組明顯增多（t＝3．52，P＜0．01），而nNOS、iNOS的mRNA 表達水平差異均無統計學意義（P＞0．05）。見圖2。

圖2 SAMP8鼠海馬區一氧化氮合成酶mRNA 表達比較

3 討論

快速衰老型小鼠（SAMP8）為近交系小鼠，以壽命短，短期內出現類似人類衰老相關行為學和病理生理學等優勢，已成為理想的AD 動物模型。SAMP8平均壽命為12個月，一般在4～6月齡出現加速衰老特點，且隨年齡增長表現學習記憶障礙、低恐懼不安狀態、情感障礙等。雖與人類β-淀粉樣蛋白前體（APP）不同的是SAMP8 鼠神經系統主要是APP695，但其氨基酸序列89．5%同源于人類。若給SAMP8鼠注射Aβ的抗人抗體，海馬免疫組化發現Aβ沉積呈年齡相 關 性［6］，Poon等［7］在SAMP8 鼠腦室內注射針對APP 的Aβ序列反義寡核苷酸減少APP 表達及其氧化應激形成蛋白羰基化，改善SAMP8鼠學習記憶功能。2月齡SAMP8鼠腦組織即可見Aβ沉積，4～9月齡加速沉積。與AD 相關的另一特征性tau蛋白，5月齡SAMP8鼠腦內過磷酸化tau蛋白開始增多［8］。為了更好進行SAMP8鼠行為學檢測，本實驗選取加速衰老期（4月齡）小鼠開始環境干預，6月齡時應用Morris水迷宮及開放場檢測空間學習記憶能力及排除因衰老引起活動障礙及情感障礙等干擾因素。

Morris水迷宮是上世紀英國心理學家Morris設計，并應用于檢測動物學習記憶的重要工具［9］，潛伏期、路程及平均速度是Morris水迷宮檢測小鼠空間學習記憶的常用參數［10］。我們實驗結果表明，EE 組學習記憶能力較SE 組明顯增加，主要表現在潛伏期與游泳路程，但是平均速度兩者差異無統計學意義，盡管已有研究將游泳速度作為描繪學習記憶的另一參數［1］，而其關系并非直接相關。Van Dam等［11］在APP23轉基因模型實驗中也發現組間的小鼠游泳速度之間無差異，換個角度思考，SAMP8鼠在速度相同的條件下利用較短的時間和距離找到潛在的平臺說明了小鼠的學習記憶能力的提高，與實驗結論并不矛盾，正如臨床上AD患者與正常人在行動上速度上無明顯差別類似。

另外，實驗中為了不同層面探索豐富環境對SAMP8鼠的行為影響及排除焦慮對空間學習記憶的可能干擾，進行了開放場試驗。直立次數與穿格數反映小鼠的探索能力；理毛次數與糞便顆粒數反映了小鼠對新環境的滿意程度，即焦慮指標。實驗中我們發現與焦慮相關指標（糞便顆粒、理毛次數）組間差異無統計學意義，且EE 組的垂直探索能力（直立次數）較SE組明顯增強，支持了水迷宮結論。然而，與2組的水平探索能力相關的穿格數之間差異無統計學意義，但EE組較SE組存在增加趨勢，考慮可能與系統計數及樣本量有關。

研究證實，NOS與學習記憶密切相關［12-13］，目前發現神經系統存在3 種一氧化氮合成酶，分別為iNOS、eNOS、nNOS。NOS催化生成NO，低濃度NO 作為逆行遞質活化鳥苷酸環化酶，增加突觸后膜Ca2＋通透性，再次激活NOS，放大和延長神經信號，完成長時程增強，并可通過復雜信號網絡，起促進神經生長及抗凋亡作用；高濃度NO 與氧自由基產生過氧亞硝酸根，誘導氧化應激，導致tau蛋白酪氨酸殘基硝基化和羰基化，抑制過磷酸化tau蛋白分解，并阻礙熱休克蛋白90介導tau蛋白正確剪切／聚集，共同促進神經纖維纏結形成。iNOS 是與AD 發病相關應激反應主要酶之一，可觸發高濃度NO 而損傷學習記憶［14］。本實驗未發現2組iNOS及其mRNA 的表達水平上存在差異，這可能與選取的SAMP8鼠的年齡相關，有理由推測iNOS可能參與晚期學習記憶損傷。nNOS和eNOS是生理條件下基礎表達的組織構成酶，參與學習記憶障礙的整個進程，nNOS 基因敲除小鼠表現明顯記憶功能損傷［15］，在SAMP8 小鼠海馬區nNOS的表達隨年齡增加而逐漸下降［16］。實驗中發現豐富環境明顯延緩隨年齡增長而引起的nNOS蛋白水平下降，但Real-time PCR未檢測到nNOS的mRNA 表達增加，推測豐富環境可能從翻譯水平上影響nNOS的表達，有待進一步研究。eNOS主要來源于血管內皮細胞，目前，文獻關于eNOS調節Aβ沉積一直存在爭議，很可能與模型的選擇或來源于NOS的NO 空間或時間分布差異有關，Austin等［17］發現通過抑制培養的腦血管內皮細胞或使用eNOS-／-小鼠可以上調APP、β降解酶和Aβ的沉積，與其結果一致，本實驗EE組eNOS的蛋白和mRNA 表達水平均較SM 組增加，說明豐富環境，即活動空間增加、更多的個體間交往，以及所接觸環境的多變性和新穎性可直接延緩學習記憶功能損傷，可能為腦血管事件參與學習記憶損傷提供證據。

綜上所述，在SAMP8 鼠加速衰老期，豐富環境可能通過調節一氧化氮合成酶的表達水平延緩學習記憶能力衰退上發揮重要作用，為阿爾茨海默病的社會心理治療提供理論支持。

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