吲達帕胺緩釋片有關物質測定

袁春平，張文芳，梁華娟，吳志權

(廣東環球制藥有限公司，佛山 528305)

吲達帕胺屬噻嗪類利尿藥，是一種有效的作用強的利尿降壓藥物[1]。該緩釋片治療劑量低，療效明顯，體內積蓄少，適合高血壓患者長期應用[2-3]。為更好地控制產品質量，將雜質可能帶來的安全性隱患降至最小，本研究建立兩種高效液相色譜(HPLC)法測定吲達帕胺緩釋片的有關物質，方法一采用外標法測定吲達帕胺緩釋片中4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸(起始原料)，加校正因子的主成分自身對照法測定雜質B(脫氫吲達帕胺，主要的降解雜質)，并對其他單雜質及總雜質進行控制;雖然方法一能良好分離雜質A(N-亞硝基-2-甲基吲哚啉)，但由于進樣量和檢測限的限制，需建立方法二測定雜質A。報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-10AT高效液相色譜儀;島津LC-20AT高效液相色譜儀，SPD-M20A二極管陣列檢測器。AL104型、MS105DU型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，分別為萬分之一和十萬分之一天平]。

1.2 試藥 吲達帕胺緩釋片(廣東環球制藥有限公司研制，規格:每片 1.5 mg，批號:110301，110302，110303)，吲達帕胺對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:100257-200903);吲達帕胺雜質 B對照品(USP，批號:1338812)，4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸(東京化成工業株式會社，批號:SQ5AD-EJ)，吲達帕胺雜質A對照品(EP，批號:2.1);乙腈、四氫呋喃、冰醋酸、三乙胺為色譜純，超純水為自制，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸和雜質B的測定(方法一)

2.1.1 色譜條件 Welch Ultimate C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:水∶乙腈∶2-丁醇∶三乙胺∶十二烷基硫酸鈉溶液(取十二烷基硫酸鈉5 g，加冰醋酸3 mL，加水100 mL，搖勻)=690∶310∶20∶10∶6(用磷酸調節pH至3.0);檢測波長240 nm，流速1.6 mL·min－1，柱溫 30 ℃，進樣量 20 μL。

2.1.2 溶液的配制

2.1.2.1 供試品溶液 取本品適量研細，取細粉適量(相當于吲達帕胺15 mg)，精密稱定，置50 mL量瓶中，加乙醇適量充分振搖使溶解并稀釋至刻度搖勻。離心，精密量取上清液2 mL，置5 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2.2 供試品-自身對照溶液 精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2.3 4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸對照品溶液 取4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸對照品約12.5 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 mL，置100 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為貯備溶液，精密量取貯備溶液2.4 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2.4 系統適用性溶液 取雜質B、4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸對照品各約1.2 mg，精密稱定，置同一個100 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為雜質貯備溶液;另取雜質A對照品約1.2 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質A貯備溶液;精密稱取吲達帕胺對照品約3 mg，置10 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置5 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為吲達帕胺對照品貯備溶液。分別精密量取雜質貯備溶液2.4 mL、雜質A貯備溶液1 mL、吲達帕胺對照品貯備溶液1 mL，置同一個10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2.5 空白輔料溶液 取處方比例的空白輔料適量，精密稱定，加乙醇適量充分振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液2 mL加流動相稀釋至5 mL，搖勻，即得。

2.1.2.6 空白溶劑 取乙醇2 mL，置5 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 專屬性實驗 精密量取系統適用性溶液、空白溶劑、4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸對照品溶液、空白輔料溶液、供試品溶液和自身對照溶液各20 μL，注入液相色譜儀，空白溶劑及空白輔料溶液對有關物質檢查無干擾，吲達帕胺與已知雜質4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸峰、雜質A、雜質B分離情況良好。見圖1。

2.1.4 破壞性實驗 取本品研碎，取細粉適量(相當于吲達帕胺15 mg)，精密稱定，分別通過加入5 mol·L－1鹽酸溶液水浴20 min(破壞后加堿中和至中性)、加入5 mol·L－1氫氧化鈉溶液室溫放置14 h(破壞后加酸中和至中性)、加入30%過氧化氫溶液室溫放置8 h、紫外燈[200 W·h－1·(m2)－1]下14 d 和水浴24 h 的方式進行酸性、堿性、氧化、光照和高溫破壞性實驗。結果見圖2，吲達帕胺與各種破壞條件下產生的雜質分離情況良好，二極管陣列檢測器對吲達帕胺主峰進行峰純度分析，純度因子均在閾值限度之內，顯示主峰為單一物質。

圖1 6種溶液HPLC色譜圖

圖2 強破壞實驗HPLC圖(方法一)

2.1.5 線性關系考察及校正因子的測定 取吲達帕胺、雜質B和4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸峰對照品各適量，精密稱定，分別用流動相依次稀釋制成濃度為1.790～0.030 μg·mL－1，1.005 ～ 0.038 μg·mL－1，1.178 ～0.007 μg·mL－1的6 個系列溶液，精密量取20 μL，注入色譜儀，記錄峰面積。以濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線。以兩條線性方程的斜率計算雜質B相對于吲達帕胺的校正因子f。為驗證校正因子的準確性，改變實驗儀器、日期、實驗人員，照上述方法重復實驗。由兩次實驗可知，雜質B相對于吲達帕胺的校正因子f為0.7。4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸的線性方程為Y=34 661X+242.28，r=0.999 9。

2.1.6 重復性實驗 取同一批樣品(批號:130101)6份，精密稱定，照“2.1.2”項方法分別制成供試品溶液和自身對照溶液。在上述色譜條件下測定，供試品中均未檢出4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸，雜質B的平均含量為0.14%，RSD 為0.81%(n=6)。

2.1.7 中間精密度實驗 精密稱取同一批樣品(批號:130101)，6份，改變分析日期、人員、設備，照“2.1.2”項下方法平行制成供試品溶液和自身對照溶液。在上述色譜條件下測定。供試品中均未檢出4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸，結合重復性實驗結果計算，雜質B 的平均含量為0.14%，RSD 為1.00%(n=12)。

2.1.8 定量限和檢測限 取雜質B、吲達帕胺及4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸對照品各適量，精密稱定，加乙醇溶解并稀釋制成較濃的貯備液，再用流動相逐級稀釋后進樣，分別按10倍和3倍的信噪比計算其定量限和檢測限。吲達帕胺、雜質B、4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸的檢測限分別是 0.20，0.52，0.05 ng，定量限分別是0.58，1.49，0.14 ng。

2.1.9 穩定性實驗 取“2.1.2”項下供試品溶液，室溫放置 7 d，分別于0，2，4，6 h 和第 2，3，4，5，6，7 天時進樣20 μL，記錄色譜圖，結果供試品中均未檢出4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸，雜質B峰面積的RSD為1.31%，表明供試品溶液在室溫放置7 d穩定。

2.1.10 加樣回收率實驗 取同一批樣品(批號:110301)適量(約相當于吲達帕胺15 mg)，9份，精密稱定。分加精密加入雜質B貯備液3，6，9 mL，各濃度平行操作3份，照“2.1.2”項方法制備供試品溶液，照上述色譜條件進樣測定，記錄峰面積，平均回收率為100.7%，RSD=0.72%(n=9);另取4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸儲備液，同法操作，記錄峰面積，平均回收率為97.6%，RSD=1.24%(n=9)。表明本方法準確性良好。

2.1.11 外標法和加校正因子的主成分自身對照法分別測定雜質B的含量 取不同批次樣品，分別采用雜質B對照品外標法和加校正因子的主成分自身對照法進行雜質B含量檢查，2種測定方式的結果差異無統計學意義，見表1。

表1 吲達帕胺緩釋片中雜質B測定結果(方法一) %

2.2 雜質A的測定(方法二)

2.2.1 色譜條件 Waters Symmetry Shield TM C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);以乙腈-四氫呋喃-1.5 g·L－1三乙胺溶液(用磷酸調節pH至2.8)=(7∶20∶73)為流動相;檢測波長305 nm;柱溫 30℃，流速1.4 mL·min－1，進樣量500 μL。

2.2.2 溶液的配制

2.2.2.1 空白溶劑 取乙腈 5 mL，置 10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2.2 空白輔料溶液 稱取處方比例的空白輔料適量(相當于主藥量25 mg)精密稱定，置25 mL量瓶中，精密加乙腈20 mL，充分搖勻，離心，精密量取上清液4 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2.3 供試品溶液 取本品細粉適量(相當于吲達帕胺25 mg)，精密稱定，置25 mL量瓶中，精密加入乙腈20 mL。密塞，振搖使溶解，離心，取上清液，即得供試品貯備溶液。精密量取供試品貯備溶液4 mL，置10 mL量瓶中，加乙腈1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.2.4 雜質A對照品溶液 取雜質 A 對照品1.25 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶，加乙腈溶解并定量稀釋制成每毫升中約含0.125 μg的溶液，即得雜質A貯備溶液。精密量取雜質A貯備溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得雜質A對照品溶液。

2.2.2.5 混合溶液 精密量取供試品貯備溶液4 mL、雜質A貯備溶液1 mL，置同一個10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 專屬性 精密量取“2.2.2”項下的空白溶劑、空白輔料溶液、供試品溶液、混合溶液、雜質A對照品溶液各500 μL，注入液相色譜儀，色譜圖見圖3，結果表明混合溶液中吲達帕胺峰與雜質A峰分離度良好，空白溶劑、空白輔料對樣品中雜質A的檢查無干擾。

2.2.4 強破壞實驗 取本品細粉適量，分別通過加入5 mol·L－1鹽酸溶液水浴20 min(破壞后加堿中和至中性)、加入5 mol·L－1氫氧化鈉溶液室溫放置14 h(破壞后加酸中和至中性)、加入30%過氧化氫溶液室溫放置2 h、紫外燈[200 W·h－1·(m2)－1]下14 d和水浴24 h的方式進行酸、堿、氧化、光照和加熱破壞性實驗，結果顯示各種破壞下產生的雜質與吲達帕胺分離良好。見圖4。

2.2.5 線性關系考察 精密量取“2.2.2”項下雜質A 貯備溶液 0.6，0.8，1.0，1.2，1.6，2.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升中含雜質 A 0.007 6 ～0.025 2 μg的系列濃度對照品溶液(相當于雜質含量 15～50 μg·g－1)。分別精密量取500 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖，以濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，得線性回歸方程 Y=518.03X+0.055 4，r=0.999 9。

2.2.6 穩定性實驗 取“2.2.2”項下的供試品溶液和混合溶液于室溫條件下放置，在0，2，4，8，24 h分別進樣測定，記錄色譜圖，供試品溶液中均未檢出雜質A，混合溶液中雜質A峰面積的RSD為1.59%，表明供試品溶液在室溫放置24 h穩定。

2.2.7 精密度實驗 取“2.2.2”項下的供試品溶液和混合溶液，重復進樣6次，供試品溶液中均未檢出雜質A，混合溶液中雜質A峰面積的RSD為1.48%。改變分析日期、人員、設備、同法測定。計算得雜質A峰面積的RSD為1.67%。

圖3 空白溶劑、空白輔料、雜質A對照品、供試品和混合溶液的HPLC圖

圖4 強破壞實驗HPLC圖(方法二)

2.2.8 定量限和檢測限 取“2.2.2”項下的雜質A對照品溶液，采用逐步稀釋法，分別按10倍和3倍的信噪比計算其定量限和檢測限。雜質A的定量限為3.0 ng，檢測限為1.0 ng。

2.2.9 樣品測定 取中試3批吲達帕胺緩釋片(批號:110301，110302，110303)，考察長期穩定性實驗中雜質A的含量變化，結果見表2。

表2 吲達帕胺緩釋片中雜質A含量測定結果(方法二)μg·g－1

3 討論

本實驗考察《中華人民共和國藥典》2010年版(CP2010)吲達帕胺片標準[4]有關物質測定的色譜條件，流動相為甲醇-水-醋酸(45∶55∶0.1)時不能有效分離已知雜質4-氯-3-磺酰胺苯甲酸。經考察，《英國藥典》2010版(BP2010)吲達帕胺片標準[5]有關物質的流動相(水-乙腈-2-丁醇-三乙胺-十二烷基硫酸鈉溶液=690∶310∶20∶10∶6)能有效分離自研制劑的雜質和各種破壞條件下產生的雜質。

國內外藥典標準中吲達帕胺制劑有關物質檢測的供試品處理方法主要有兩種，一是緩釋片研細混勻后取細粉溶解，二是直接取整片溶解，振搖2 h。本品經兩種方式處理后的檢驗結果無明顯差異，鑒于本品為高分子材料骨架緩釋片，取整片振搖需時長，增加雜質增長的風險。因此選擇第一種處理方法。

BP2010版采用雜質對照品外標法測定雜質B含量。由于雜質B對照品昂貴且不易獲得，本實驗采用加校正因子的主成分自身對照法測定，方法準確可行。

BP2010版僅在吲達帕胺原料中控制雜質A的限度(5 μg·g－1)，制劑中并無控制。在自研吲達帕胺緩釋片穩定性研究過程中發現雜質A的含量隨儲存時間延長有所增加，故建立制劑中雜質A的檢測方法并進行方法學驗證，對其安全性進行控制。方法一中雖然能檢測到雜質A，但由于自研制劑中只有微量雜質A，受方法一的進樣量和檢測波長(240 nm非最大吸收波長)的限制，雜質 A的內控限度上限值(50 μg·g－1)在方法一的測定條件下不能被檢出，故建立方法二進一步控制雜質A的量。由于本品的雜質A屬于痕量雜質，本實驗采用減差法減少測定的誤差。

綜上所述，本實驗建立的兩個方法專屬性強，操作簡便，準確靈敏，能有效分離吲達帕胺緩釋片中的雜質，能在雜質譜層面上有效控制雜質含量，保證制劑安全、質量可控。

[1]胡玉欽，于洋，楊漢煜，等.吲達帕胺緩釋膠囊生物等效性及藥物動力學研究[J].中國醫藥工業雜志，2006，37(7):483－485.

[2]謝清春，陳燕忠，呂竹芬，等.吲達帕胺緩釋片的制備及體外釋放度測定[J].廣東藥學院學報，2010，26(6):561－563.

[3]崔升淼，趙春順，何仲貴.吲達帕胺緩釋片的研制及釋藥機理考察[J].中國醫院藥學雜志，2003，23(7):397 －399.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:345－346.

[5]British Pharmacopoeia Commission.British Pharmacopoeia[M].London:the Stationary Office Press，2013:3020.