液質聯用法測定不同貯存期黃芩中6種黃酮類化合物含量*

徐楊璐，趙勝男，劉素麗，李守拙

(承德醫學院河北省中藥研究與開發重點實驗室，承德 067000)

黃芩主產于河北、山西、陜西、內蒙古等地，是我國常用中藥材之一，已有悠久的用藥歷史。該藥為唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根，其性苦味寒，有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效[1]。品種、產地、采收期及貯存期等條件不同導致中藥材質量產生差異，影響其制劑質量穩定性。已有文獻對不同品種、產地、采收期黃芩中的主要成分進行了研究[2-5]，但不同貯存期對黃芩藥材的化學組分及其質量有無影響，筆者尚未見報道，也沒有針對黃芩貯存時間相應的國家標準，導致保存多年的黃芩藥材還在市場上流通。這些藥材可能因為蟲蛀、變色、霉變等，使藥材中的化學成分比例或者成分種類產生變化，使藥材品質降低，影響其安全性和有效性。因此應科學有效地控制藥材貯存期，保證得到效果好、質量高的中藥材。筆者采用目前廣泛應用的液質聯用技術[6-11]對不同貯存期黃芩進行研究，以黃芩中6種黃酮類化合物作為含量測定指標，分別考察了貯存 0，1，3，6，12，18，24個月其含量變化情況及其穩定性，以期全面有效合理地評價并控制不同貯存期黃芩的質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 6310系列液相色譜-質譜聯用儀(安捷倫公司):6310質譜儀，1100 Series高效液相色譜儀;HC-2062高速離心機(科大創新股份有限公司);Mettler AG245分析天平(梅特勒-托利多有限公司，十萬分之一天平);KQ-700型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 對照品黃芩苷(批號:715-9506，含量 ＞98%)、黃芩素(批號:111595-200604，含量 ＞98%)、漢黃芩素(批號:111514-200403，含量＞98%)均購自中國食品藥品檢定研究院，漢黃芩苷(批號:20090319，含量 ＞98%)、白楊素(批號:090518，含量 ＞98%)、千層紙素A(批號:20091124，含量＞98%)均購自上海順勃生物工程技術有限公司;甲醇、乙腈(Fisher Scientific公司)為色譜純;甲酸、乙酸乙酯等試劑均為分析純。

黃芩樣品采自河北省承德地區，藥材產地由課題組人員親自考察，藥材由中國科學院植物研究所系統與進化植物學國家重點實驗室周世良研究員鑒定為正品黃芩。將藥材采用完全隨機分組法分成7批，置于室溫條件下，分別于0，1，3，6，12，18，24 個月取樣測定。

2 方法與結果

2.1 液相色譜-質譜(liquid chromatography-mass spectrometer，LC-MS)條件

2.1.1 LC條件 色譜柱為 Agilent Zorbax XDB-C18柱(2.1 mm ×150 mm，3.5 μm);流量0.2 mL·min－1;進樣量2 μL;柱溫25℃;檢測波長276 nm;流動相為0.1%甲酸-水(A)和乙腈(B)，平衡時間為 10 min，梯度洗脫，洗脫程序如下:0～10 min，18%→20%B;→18 min，20% →25%B;～30 min，25% →30%B;～40 min，30%→40%B;～60 min;40%→60%B。

2.1.2 MS 條件 離子源:電噴霧離子(electrospray ionization，ESI)源;檢測方式:多反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)模式;采用正離子模式檢測;電噴霧電壓3 500 V，霧化氣體為氮氣，霧化氣壓力25 psi;干燥氣體為氮氣，干燥氣體積流量10 L·min－1;離子源溫度350℃;碰撞氣體為高純氦氣。6種成分的MS參數見表1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素對照品各適量，精密稱定，置同一10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，作為混合對照品貯備液。精密量取混合對照品貯備液適量，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素濃度分別為 1 772，465，52，104，8，8 μg混合對照品溶液。

表1 6種成分的MS參數Tab.1 MS parameters of six ingredients

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取黃芩粉末約0.25 g，置平底圓底燒瓶中，精密加入溶劑(水∶乙醇∶乙酸乙酯∶冰醋酸=50∶49∶5∶1)25 mL，稱定，加熱回流90 min，靜置放冷，再次稱重，用溶劑補足減失的質量，12 000 r·min－1(r=5.5 cm)離心10 min，取上清液過孔徑0.45 μm微孔濾膜稀釋10倍，作為供試品溶液。

2.3 線性關系考察 精密量取不同體積混合對照品溶液，用甲醇定量稀釋，制得7種不同質量濃度的混合對照品溶液，按上述LC-MS條件進樣測定，記錄色譜圖。以對照品質量濃度(X)為橫坐標，峰面積積分值(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性關系考察，結果見表2。

表2 6種成分的線性關系考察結果Tab.2 Linear relations of six ingredients

2.4 精密度實驗 精密吸取同一混合對照品溶液適量，按上述LC-MS條件連續進樣6次，測定峰面積。結果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素的 RSD 分別為 1.8%，2.4%，0.94%，1.1%，2.0%，1.2%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復性實驗 取同一份黃芩樣品0.25 g，共6份，分別按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，按上述LC-MS條件進樣測定，計算各成分的含量。結果，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素含量的平均值分別為 8.19%，0.52%，1.84%，0.51%，0.04%，0.05%，RSD 分別為 2.3%，1.5%，1.7%，1.3%，2.5%，1.1%，表明方法重復性良好。

2.6 穩定性實驗 精密吸取同一供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12 h進樣測定峰面積。結果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素的 RSD 分別為 1.86%，2.23%，1.67%，2.14%，1.95%，2.68%。表明供試品溶液在室溫放置12 h內基本穩定。

2.7 加樣回收率實驗 精密稱取同一黃芩樣品0.125 g，共6份，分別精密加入一定量的混合對照品貯備液，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，照上述LC-MS條件進樣測定，計算加樣回收率，結果見表3。

2.8 樣品含量測定 取各貯存期的黃芩樣品，分別按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，照上述LC-MS條件進樣測定，記錄峰面積，分別計算各樣品中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素的含量，結果見表4。

2.9 結果 由實驗結果可知，黃芩苷在貯存1個月含量明顯下降，貯存1～3個月含量略呈上升趨勢，貯存3～18個月含量變化不大;漢黃芩苷貯存1個月內含量明顯下降，貯存1～6個月含量穩定，貯存6～18個月含量略呈下降趨勢;黃芩素貯存0～3個月含量下降，貯存3～6個月含量上升，貯存6～18個月含量略呈下降趨勢;漢黃芩素貯存0～3個月含量下降，貯存3～18個月含量不穩定，但變化不大;白楊素和千層紙素在黃芩中的含量很低，貯存0～18個月整體含量變化不大。

3 討論

黃酮類成分中含有酚羥基，如果采用中性流動相會有拖尾現象，尤其是黃芩苷，因此需在流動相中加入少量酸抑制其拖尾現象，筆者在流動相中加入0.1%甲酸，峰形得到很好改善。黃酮苷元類化合物在正負離子模式都有高靈敏度的響應，但正離子模式一般稍好于負離子模式[12]。因此測定黃芩中的黃酮類成分采用正離子模式。

中藥是一個復雜體系，要體現其多組分、多層次、多靶點的作用特點，本實驗初步研究貯存18個月的黃芩中6個黃酮類化合物含量變化情況，從結果中可以看出貯存前3個月黃芩中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素含量整體呈下降趨勢，4～18個月它們含量變化都不明顯。筆者將繼續跟蹤貯存24個月后黃芩中6種黃酮類化合物的含量變化，以確定黃芩中主要成分含量明顯變化的時間，同時采用植物遺傳(DNA)分析、紅外光譜分析、植物代謝組學分析等技術對黃芩藥材中的化學組分進行分析，不斷完善黃芩的質量標準。此外，中藥材的質量好壞應該以其臨床療效為最終的評判標準，不一定含量高療效就好，此實驗也為揭示臨床用藥標準與療效之間的關系打下了基礎。

表3 6種成分加樣回收率實驗結果Tab.3 Results of recovery tests of six ingredients n=6

表4 不同貯存期黃芩中6種成分的含量Tab.4 Contentsofsix ingredientsin Scutellaria baicalensis Georgi with different storage period %

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