溫胃陽膠囊中揮發(fā)油提取及包合工藝*

唐勇琛，梁學政，呂建偉，謝勝，甄漢深，丘琴，曾坤

(1.廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院藥學部，柳州 545001;2.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，南寧 530001)

溫胃陽膠囊是廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院在臨床實踐基礎上研制的純中藥制劑，目前擬作為該院制劑進行研究申報。該方由桂枝、炮姜、砂仁、益智仁、白豆蔻、法半夏、生姜、茯苓、紅參組成，方中桂枝溫陽、消痞、行滯為君;炮姜溫中通絡，散寒除脹，降逆和胃為臣;砂仁、白豆蔻行氣、溫中、化濕，益智仁溫脾暖腎，以溫補中陽之氣，使行氣、祛寒濕而不傷正，共為佐使，臨床用于治療中陽虧虛特別是胃陽不足所致的功能性消化不良。桂枝的主要有效成分為桂皮醛，為揮發(fā)油性成分，且方中的炮姜、砂仁、益智仁、白豆蔻均為姜科植物，含有豐富的揮發(fā)油，而其所含揮發(fā)油均為有效成分，由于這類成分具有較強的揮發(fā)性，在提取及制備過程中易損失，為保證藥效，需將此類成分單獨提取處理后入藥。因此，筆者在本實驗中采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，并以 β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin，β-CD)對揮發(fā)油進行包合，以最大程度保留有效成分，從而保證該復方制劑的臨床療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 揮發(fā)油提取器(上海醫(yī)用分析儀器廠，型號:HAD-1 000 mL);101A-3E電熱鼓風干燥箱(上海實驗儀器有限公司);BP211D電子天平(德國賽多利斯，感量:0.01 mg);98-Ⅱ-B電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司);FW100高效萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司);GC2105格力電磁爐(格力電器中山市小家電制造有限公司)。

1.2 試藥 桂枝、炮姜、砂仁、益智仁、白豆蔻均購于南寧生源中藥飲片有限責任公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學寧小清高級實驗師鑒定，均符合《中華人民共和國藥典》2010版中藥飲片的規(guī)定，均為正品;β-CD(郁南縣永光環(huán)狀糊精有限公司，批號:20120502);無水硫酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司，批號:F200060515，含量≥99%);其他試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的提取工藝

2.1.1 揮發(fā)油提取正交實驗設計 根據(jù)預實驗結(jié)果及文獻報道[1-2]，以揮發(fā)油得率為考察指標，對藥材揮發(fā)油得率影響較大的加水量、藥材粒徑及提取時間3個因素進行考察。每個因素選取3個水平設計正交實驗方案，按L9(34)正交表安排實驗，平行操作，因素水平見表1。

表1 揮發(fā)油提取工藝因素及水平Tab.1 Factors and levels of extraction technology for volatile oil

2.1.2 方法及數(shù)據(jù)處理 按處方比例分別稱取桂枝、炮姜、白豆蔻、砂仁及益智仁共85 g，按正交實驗表下設計的實驗條件進行揮發(fā)油提取。按《中華人民共和國藥典》2010年版(一部)附錄ⅩD揮發(fā)油測定法提取揮發(fā)油，冷卻后讀取其體積。揮發(fā)油得率(%)=(揮發(fā)油體積/生藥材質(zhì)量)×100%(mL·g－1)。正交實驗結(jié)果及直觀分析見表2，方差分析見表3。

表2 揮發(fā)油提取工藝條件L9(34)正交實驗結(jié)果Tab.2 Results of L9(34)orthogonal experiment on extraction technology for volatile oil

表3 揮發(fā)油提取工藝方差分析表Tab.3 Variance analysis on extraction technology for volatile oil

2.1.3 結(jié)果分析 由正交實驗直觀分析(表2)結(jié)果可知，最佳組合為A2B2C3。根據(jù)極差值大小，對揮發(fā)油提取影響大小順序依次為:C(提取時間)＞B(藥材粒徑)＞A(加水倍數(shù))。而方差分析結(jié)果(表3)表明:因素B、C，即藥材粒徑與提取時間對揮發(fā)油提取有顯著影響，B因素K2最大，故選2水平，C因素K3最大，故選3水平，因素A差異無統(tǒng)計學意義，即加水倍數(shù)對實驗結(jié)果影響不大，同時出于節(jié)能考慮，加水量可選擇較低水平，因此最后確定最佳工藝為A1B2C3，即:藥材粉碎(過10目篩)，加6倍水量，提取5 h。

2.1.4 揮發(fā)油提取工藝驗證實驗 按最佳工藝條件A1B2C3，即:藥材粉碎(過10目篩)、加6倍水量、提取5 h，進行實驗，投料3批進行工藝驗證，結(jié)果揮發(fā)油得率均較高，平均為1.72%，RSD=4.03%。表明該工藝穩(wěn)定可行，可較好地應用于工業(yè)化生產(chǎn)，結(jié)果見表4。

表4 揮發(fā)油提取工藝驗證實驗結(jié)果表Tab.4 Verification results of extraction technology for volatile oil

2.2 揮發(fā)油的包合工藝

2.2.1 揮發(fā)油包合工藝正交實驗設計 本實驗結(jié)合文獻報道，以對揮發(fā)油包合物影響較明顯的3個因素:β-CD與油的投料配比、加水量、研磨時間為主要考察因素，采用正交設計，各取3個水平，并以包合物收率和揮發(fā)油包合率的綜合評分(權重系數(shù)分別為0.3，0.7)為考察指標，進行L9(34)正交實驗。因素及水平見表 5[3-6]。

2.2.2 揮發(fā)油包合物的制備及測定 精密稱取β-CD24.0 g，精密稱定質(zhì)量，加適量水研磨均勻，邊研磨邊滴加一定量以2倍量乙醇稀釋的揮發(fā)油，共同研磨1 h，抽濾，加無水乙醇洗滌沉淀3次，每次5 mL，于40℃真空干燥24 h，即得揮發(fā)油β-CD包合物，放置待測。稱取包合物10.0 g，精密稱定，加入2倍量乙酸乙酯洗滌，晾干，加水100 mL，按《中華人民共和國藥典》2010年版(一部)附錄ⅩD揮發(fā)油測定法進行測定。其中，包合物收率(%)=包合物質(zhì)量(g)/[揮發(fā)油質(zhì)量(g)+β-CD質(zhì)量(g)]×100%;揮發(fā)油包合率(%)=包合后提取的揮發(fā)油質(zhì)量(g)/加入揮發(fā)油的總質(zhì)量(g)×100%[3，5，7-8]。正交實驗結(jié)果及直觀分析見表6，方差分析見表7。

表5 揮發(fā)油包合工藝因素及水平Tab.5 Factors and levels of inclusion technology for volatile oil

2.2.3 結(jié)果分析 由表6直觀分析可知，最佳組合為A3B1C3。根據(jù)極差值大小，對揮發(fā)油包合影響大小順序依次為:A＞B＞C。而表7方差分析結(jié)果表明:β-CD與油的投料配比對包合物的綜合影響差異有統(tǒng)計學意義，A因素K3最大，故選3水平，因素B、C差異無統(tǒng)計學意義，即加水量和研磨時間對于實驗結(jié)果影響不大，同時出于節(jié)能考慮，加水量和研磨時間可選擇較低水平，因此最后確定最佳工藝為 A3B1C1，即:β-CD與油的投料配比為8∶1、加水量為1倍、研磨時間為30 min。

2.2.4 揮發(fā)油包合工藝驗證實驗 按上述最佳工藝條件A3B1C1，即β-CD與油的投料配比為8∶1、加水量為1倍、研磨時間為30 min。投料3批進行工藝驗證，結(jié)果包合物收率和揮發(fā)油包合率均較高，表明該工藝穩(wěn)定可行，可較好地應用于工業(yè)化生產(chǎn)，結(jié)果見表8。

實驗結(jié)果表明，以A3B1C1，即β-CD與油的投料配比為8∶1、加水量為1倍、研磨時間為30 min進行實驗，平均包合物收率為93.01%，RSD為0.27%;平均揮發(fā)油包合率為74.82%，RSD為0.04%，結(jié)果均較理想。工藝條件合理、穩(wěn)定、可行。

2.3 揮發(fā)油包合物的TLC鑒別 稱取揮發(fā)油β-CD包合物0.2 g，以無水乙醇5 mL超聲溶解15 min，離心后取上清液，即得包合物樣品溶液①;精密移取包合前揮發(fā)油0.1 mL，以無水乙醇5 mL稀釋溶解即得包合前揮發(fā)油樣品溶液②;取適量包合物以水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油，精密移取所回收揮發(fā)油0.1 mL，以無水乙醇5 mL稀釋溶解，即得包合后揮發(fā)油樣品溶液③;β-CD 0.2 g，加入揮發(fā)油 0.1 mL，使其充分混勻，再以無水乙醇5 mL超聲溶解15 min，離心后取上清液，即得混合物樣品溶液④。分別吸取適量上述4份樣品溶液點樣于同一硅膠板上，以石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯(85∶15)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果揮發(fā)油、包合物中回收的揮發(fā)油以及揮發(fā)油與β-CD混合物在硅膠板上顯相同的斑點(斑點的Rf值和顏色一致)，而包合物提取液則無相應的斑點。表明揮發(fā)油已包合于β-CD內(nèi)部，形成了穩(wěn)定的與混合物物相不同的包合物，包合物表面基本無揮發(fā)油附著，且包合前后揮發(fā)油成分未發(fā)生變化，包合過程對揮發(fā)油化學成分無影響。見圖1。

表6 揮發(fā)油包合工藝條件L9(34)正交實驗結(jié)果Tab.6 Results of L9(34)orthogonal experiment on inclusion technology for volatile oil

表7 揮發(fā)油包合工藝方差分析表Tab.7 Variance analysis on inclusion technology for volatile oil

表8 揮發(fā)油包合工藝驗證實驗結(jié)果表Tab.8 Verification results on inclusion technology for volatile oil

3 討論

筆者在本研究中通過正交實驗確立溫胃陽膠囊揮發(fā)油提取及包合工藝中的參數(shù)，確定揮發(fā)油的最佳提取及包合工藝條件，并進行工藝驗證，證明該工藝合理、穩(wěn)定、可行，可為工業(yè)化生產(chǎn)條件的制定提供理論依據(jù)。在揮發(fā)油提取工藝研究的過程中，預實驗結(jié)果表明，在藥材粒徑、加水量、浸泡時間、提取時間4個因素中，只有藥材粒徑、加水量、提取時間3個因素對揮發(fā)油的提取量有較明顯的影響，故考慮采用藥材粒徑、加水量、提取時間作為提取揮發(fā)油正交實驗的因素，最后綜合正交實驗的方差分析和直觀分析結(jié)果優(yōu)選各因素水平。包合工藝中，β-CD包合揮發(fā)油常見的方法有飽和水溶液法和研磨法，其中研磨法因不受β-CD水中溶解度的限制，且具有包合率高、所得包合物粉末性狀細膩、便于混合等特點，因而適合于工業(yè)大生產(chǎn)。

中藥揮發(fā)油是存在于植物體內(nèi)的一類可隨水蒸氣蒸餾而得到的油狀液體，主要成分為萜類衍生物、脂肪族化合物等。它對光、空氣、溫度的影響較敏感，受其影響易分解變質(zhì)，若是在膠囊劑中直接加入揮發(fā)油，揮發(fā)油易損失且氧化變質(zhì)，經(jīng)β-CD包合后，穩(wěn)定性可顯著提高，同時也遮掩了不良氣味[9]。另外，該處方量藥材提取所得揮發(fā)油的量相當大，如果直接加入到干浸膏粉中，在60℃條件下烘干，揮發(fā)油損失量較大，而且揮發(fā)油在該制劑中為重要的有效成分，故不能直接加入處理。在β-CD包合物的制備過程中，客體的投入量大小對包合效果影響較大，在一定范圍內(nèi)可以提高包合率，但是過低或過多均會降低包合率。筆者在本實驗中對客體投入量對包合效果的影響進行探討，結(jié)果表明，β-CD與油的投料配比為8∶1、加水量為1倍時包合效果好;在低溫40℃研磨30 min，包合物收率、揮發(fā)油包合率均較高。

[1]王慶陽，林紅，韓琳.紫荊揮發(fā)油提取工藝研究[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2012，32(15):1191 －1193.

[2]王曉麗，都曉偉，張碩辛，等.肝達康中揮發(fā)油的提取工藝研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2013，24(4):879 －880.

[3]林國鋇，謝燕，李國文，等.地黃益智顆粒中揮發(fā)油提取及包合工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17(15):32－35.

[4]張?zhí)m，韓毅，樊程程，等.軟堅消癭顆粒中揮發(fā)油提取及β-環(huán)糊精包合工藝研究[J].中華中醫(yī)藥學刊，2013，31(5):974－975.

[5]徐男，蔡梅超，胡言光，等.白金婦安顆粒中揮發(fā)油β-環(huán)狀精包合物制備工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18(3):36－38.

[6]林華，樓步青，李濱萍.腦力智寶膠囊中揮發(fā)油的提取及包合工藝優(yōu)選[J].中藥材，2005，28(3):228 －229.

[7]黃濤陽，王暉.銀翹解毒顆粒中揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物的制備[J].醫(yī)藥導報，2010，29(7):928－931.

[8]陳騫，向陽，石召華，等.小兒益麻顆粒揮發(fā)油包合工藝研究[J].醫(yī)藥導報，2014，33(4):513 －514.

[9]趙慧萍，王浩，孟祥軍.β-環(huán)糊精包合技術在藥學領域應用的概述[J].沈陽醫(yī)學院學報，2009，11(2):120 －122.