內源性大麻素系統對慢性間歇低氧大鼠糖代謝的影響

朱帥俊 翁欽永 吳文偉 (福建醫科大學附屬協和醫院重癥醫學科，福建 福州 35000)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征為一種常見的慢性病，在老年人群中有較高的發病率〔1〕。研究顯示，該病與體內多臟器功能受損相關，為高血壓、冠心病、腦卒中、糖尿病等多種慢性病的獨立危險因素〔2〕。阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征主要病理生理學改變為夜間反復性慢性間歇低氧(CIH)，可明顯提升糖尿病發生率〔3〕，但引發機體糖代謝異常的相關機制仍未明確。內源性大麻素系統為內源性信號轉遞系統的一種，在調節糖代謝方面具有重要作用〔4〕。但內源性大麻素系統在阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者體內糖代謝異常中發揮的作用和相關機制仍未知。本研究探討內源性大麻系統對CIH大鼠糖代謝的影響機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 10周齡健康Wistar大鼠60只，均為雄性，體重230～260 g，購于福建醫大實驗動物中心，許可證號SCXK(閩)200420002。隨機分為4 w正常對照組、CIH組、CIH聯合利莫那班組;6 w正常對照組、CIH組、CIH聯合利莫那班組，每組各10只。

1.2 儀器與試劑 山羊抗兔CB1受體多克隆抗體、兔抗大鼠CB1受體多克隆抗體購于艾美捷科技有限公司;SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購于北京北瑞達醫藥科技有限公司;利莫那班購于武漢同興生物科技有限公司;日本東芝TBA-40FR全自動生化分析儀;瑞士羅氏Cobase411型電化學發光儀。

1.3 暴露方法 將6組大鼠分別放入型號相同的自制低氧艙，CIH組、CIH聯合利莫那班組均循環充入不同流速的純氮氣和壓縮空氣，每次循環2 min，將低氧艙中的氧氣濃度在30 s內從21.0%，下降到最低的8.0%，再于40 s內恢復到21.0%之后保持常規通氧到下個循環為止。大鼠每日暴露時間10∶00～16∶00，共6 h。CIH聯合利莫那班組在造模之前腹腔注射利莫那班，1 mg·kg-1·d-1;正常對照組充入氧氣濃度為21.0%的壓縮空氣。

1.4 空腹血糖(FPG)、血清胰島素、血清C肽測定 分別于實驗第4、6周，相應大鼠在空腹狀態下給予10%水合氯醛(0.2 ml/100 g)麻醉后，抽取股靜脈血4 ml。取其中2 ml使用全自動生化分析儀檢測空腹血糖(FPG)含量，另外2 ml使用化學發光法檢測胰島素和C肽水平。

1.5 肝臟CB1受體表達檢測 采用免疫組化法測定大鼠肝臟CB1受體表達水平，將大鼠處死后立即分離肝臟，制作石蠟切片。選用兔抗大鼠CB1受體多克隆抗體為一抗，稀釋100倍;山羊抗兔CB1受體多克隆抗體為二抗。取每張染色切片的5個視野進行觀察和采集，使用Image-pro plus 6.0軟件檢測該受體染色呈陽性的吸光度平均值。

1.6 統計學分析 采用SPSS16.0軟件，計量資料組間比較進行方差分析，兩兩比較進行t檢驗，相關性進行Spearman分析。

2 結果

2.1 各組FPG、胰島素和C肽水平比較 4 w和6 w CIH組FPG、胰島素和C肽水平均明顯高于正常對照組(P＜0.05);6 w CIH組FPG、胰島素和C肽水平均明顯高于4 w CIH組(P＜0.05);6 w CIH聯合利莫那班組FPG、胰島素和C肽水平均明顯高于4 w CIH聯合利莫那班組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組FPG、胰島素和C肽水平比較(±s，n=10)

表1 各組FPG、胰島素和C肽水平比較(±s，n=10)

與正常對照組比較:1)P＜0.05，與4 w CIH 組比較:2)P＜0.05;與4 w CIH 聯合利莫那組比較:3)P＜0.05

分組FPG(mmol/L)血清胰島素(U/L)血清C肽(μg/L)6.59±0.348.95±1.821.34±0.376 w 正常對照組 6.62±0.389.07±1.241.39±0.444 w CIH 組 9.03±0.511) 16.61±2.841) 3.42±0.281)6 w CIH 組 10.55±0.421)2)20.14±3.751)2)5.34±0.361)2)4 w CIH 聯合利莫那班組 7.73±0.2711.80±2.462.15±0.306 w CIH 聯合利莫那班組 9.22±0.303) 14.72±2.733) 3.77±0.243)4 w正常對照組

2.2 大鼠肝臟CB1受體表達情況 4、6 w正常對照組CB1受體吸光度值為(0.225±0.037)、(0.232±0.041)，4、6 w CIH 組CB1 受體吸光度值為(0.285±0.037)、(0.338±0.026)，4、6 w CIH聯合利莫那班組 CB1受體吸光度值為(0.253±0.016)、(0.310±0.027)。CB1 受體在4、6 w CIH 組陽性表達水平明顯高于正常對照組(P＜0.05)。4、6 w CIH聯合利莫那班組CB1受體陽性表達水平明顯低于CIH組(P＜0.05)。見圖1。

2.3 大鼠肝組織CB1受體表達與FPG、胰島素和C肽水平相關性 大鼠肝組織CB1受體表達與FPG、胰島素和C肽水平之間呈明顯正相關(r=0.967、0.869、0.938，P=0.016、0.020、0.009)。

圖1 大鼠肝組織CB1受體表達情況(×400)

3 討論

目前已有研究證實，阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者存在血糖上升、胰島素抵抗、腹型肥胖等多種與代謝綜合征有關的臨床癥狀，病情進一步發展會引發糖代謝異常和2型糖尿病發生風險增加〔5〕，但具體發病機制仍未明確。

前期研究顯示，阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者存在內源性大麻素系統紊亂，主要表現為CB1受體表達水平提升〔6〕。本次研究亦顯示CIH能夠提升大鼠肝臟組織CB1受體表達水平，并隨著低氧時間的變長而強度逐漸增加。由于內源性大麻素系統主要通過CB1受體來對機體多種生理功能發揮調節作用，因此對CB1受體的表達能夠有效反映出內源性大麻系統功能的改變。本次研究顯示，CIH能夠通過誘導大鼠肝臟CB1受體過度表達來引發糖代謝紊亂。其原因可能為:(1)通過CIH增強機體的交感神經系統，激活炎性和氧化應激通路，進而引發內源性大麻系統紊亂，使糖代謝出現紊亂。(2)通過下丘腦中樞神經系統及骨骼肌、肝臟等外周組織這兩種不同機制來引起胰島素抵抗及高胰島素血癥。

利莫那班為一種高特異性的CB1受體拮抗劑。研究顯示，使用利莫那班能夠有效緩解機體糖代謝異常和胰島素抵抗〔7〕。預試驗顯示，當利莫那班給藥劑量低于1 mg·kg-1·d-1時無法減弱CB1受體表達水平，因此本次實驗中在造模前給予大鼠利莫那班發揮藥效的最低劑量1 mg·kg-1·d-1進行干預。結果顯示，干預后大鼠肝臟CB1受體表達水平明顯降低，說明內源性大麻素系統紊亂能夠使CIH引起的糖代謝紊亂加強。可能機制為:(1)治療初期可通過拮抗中樞神經CB1受體來抑制食欲，進而降低攝入食物量;(2)治療后期可通過拮抗骨骼肌、肝臟等外周CB1受體來調節機體能量代謝，降低內源性大麻素系統紊亂和糖尿病的發生率。

綜上所述，CIH可增強大鼠肝臟CB1受體表達，使FPG、胰島素和C肽水平升高;利莫那班干預治療能夠有效改善糖代謝相關指標的異常狀態。但本次研究中未深入研究利莫那班藥效與給藥劑量之間的關系;此外，給予利莫那班后部分糖代謝指標降低，但未完全恢復正常水平，可能與阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征引發的糖代謝紊亂還存在有除內源性大麻素系統之外的其他通路有關。

1 韓書芝，李 沖，蘇 力，等.阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者血清內脂素的水平〔J〕.中國老年學雜志，2013;33(10):2358-60.

2 劉志青，傅柳英，李樂之，等.阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者抑郁狀況及相關因素分析〔J〕.中南大學學報(醫學版)，2010;35(10):1106-11.

3 李志剛，錢鳳文，崔如眾，等.持續氣道正壓通氣治療老年阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征合并糖尿病的臨床分析〔J〕.天津醫藥，2014;(9):912-4.

4 郭慶畬.內源性大麻素系統在2型糖尿病與肥胖中生化機制〔J〕.醫學綜述，2009;15(10):1458-61.

5 劉新兵，馮六六，黃紅漫，等.無創正壓通氣治療對冠心病合并阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者心律失常影響研究〔J〕.中國循環雜志，2014;29(1):21-5.

6 郭超花，王 強.內源性大麻素系統與阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征〔C〕.//首屆睡眠呼吸障礙性疾病多學科研討會論文集，2009:157-61.

7 趙維元.中樞類大麻受體拮抗劑利莫那班對2型糖尿病周圍神經病變療效的實驗分析〔J〕.神經疾病與精神衛生，2011;11(2):140-3.