五味子多糖對人結腸癌HT-29細胞體外增殖及侵襲能力的抑制作用

黃曉東，路　倩，沈　楠，王艷春

(1.吉林醫藥學院藥理學教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫藥學院機能實驗中心，吉林 吉林 132013)

五味子多糖對人結腸癌HT-29細胞體外增殖及侵襲能力的抑制作用

黃曉東1，路倩1，沈楠2，王艷春1

(1.吉林醫藥學院藥理學教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫藥學院機能實驗中心，吉林 吉林 132013)

目的：探討五味子多糖(ASPS)對人結腸癌HT-29細胞增殖和侵襲活性的影響，闡明ASPS的抗腫瘤作用。方法：40只 Wistar大鼠隨機分為對照組(給予生理鹽水)和100、200、400 mg·kg-1ASPS組，每組10只，取各組大鼠血清,HT-29細胞體外培養，以各組大鼠血清進行預處理，采用MTT法和Transwell小室檢測各組HT-29細胞的增殖抑制率和侵襲活性抑制率；Western blotting法檢測各組細胞上清液中bcl-2、bax和Caspase-3蛋白表達水平。結果：與對照組和100 mg·kg-1ASPS組比較，200和400 mg·kg-1ASPS組HT-29細胞增殖抑制率和侵襲活性抑制率均升高(P<0.05，P<0.01)。400 mg·kg-1ASPS組HT-29細胞上清液中bcl-2蛋白表達水平低于其他組(P<0.05，P<0.01),bax和Caspase-3蛋白的表達水平高于對照組(P<0.05，P<0.01)。結論：ASPS能顯著抑制細胞的體外增殖和侵襲能力，其機制可能與下調HT-29細胞的bcl-2基因表達，上調bax和Caspase-3基因表達，激活細胞凋亡通道有關聯。

結直腸腫瘤；五味子多糖；侵襲活性；細胞凋亡

直腸癌患者死亡的主要原因是腫瘤的復發和轉移，控制惡性腫瘤侵襲和轉移非常重要。五味子多糖(AlkalineS.chinensispolysaccharides，ASPS)為中藥北五味子中的主要成分，含有多種果糖、多聚糖、氨基酸和10余種微量元素[1-2]。大量研究[3-5]表明：ASPS可以抗腫瘤，誘導腫瘤細胞凋亡。但是其抑制腫瘤轉移及其機制均未見報道。本研究采用ASPS含藥血清對人結腸癌HT-29細胞進行預處理，觀察ASPS對HT-29細胞增殖和侵襲活性的抑制作用，并對其作用機制進行初步探討。

1　材料與方法

1.1細胞及主要試劑人結腸癌細胞株HT-29由吉林大學基礎醫學院提供；40只Wistar大鼠，SPF級，雌雄各半，體質量(180±20)g，購于吉林大學實驗動物中心(動物合格證號：SCXK吉-2012-0104)。ASPS由吉林大學藥學院藥物分析教研室自提，純度為91.4%；bax鼠抗人單克隆抗體、bcl-2鼠抗人單克隆抗體、FITC-羊抗鼠單克隆抗體、兔抗人β-肌動蛋白多克隆抗體和鼠抗人Caspase-3單克隆抗體購于北京中杉公司；Transwell小室購于美國Corning公司；蛋白Marker和PVDF膜購于凱基生物科技發展有限公司。

1.2 ASPS血清的制備40只Wistar大鼠隨機分為對照組和100、200、400 mg·kg-1ASPS組，每組10只。各ASPS組大鼠給予灌胃ASPS，每天2次，對照組大鼠灌胃生理鹽水，連續7 d。麻醉大鼠后，腹主動脈取血，離心分離血清，56℃水浴中，滅活30 min后，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-20℃保存。

1.3MTT法檢測HT-29細胞增殖抑制率用RPMI-1640培養基配制HT-29細胞懸液接種于96孔板中，每孔加200 μL，培養24 h；取出孔板棄去上清，加入10% ASPS血清200 μL，培養72 h；再棄上清，加入200 μL MTT(0.5 g·L-1)，作用4 h后，吸去上清，加入200 μL DMSO，搖床混勻10 min，于酶標儀570 nm波長處測定吸光度(A)值，重復3次。細胞增殖抑制率=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。

1.4Transwell小室法檢測HT-29細胞的侵襲活性抑制率取HT-29細胞1×105mL-1，接種于Transwell板的上室，每孔160 μL，再加入20% ASPS血清40 μL，將800 μL RPMI-1640培養基加入下室，培養24 h。倒置上室，甲醇固定20 min，PBS漂洗×2，染色5 min，蒸餾水漂洗，1%鹽酸酒精浸泡10 s，再用蒸餾水漂洗，淡氨水浸泡5 min，漂洗，依次放入體積分數為90% 和100%的酒精脫水，剪下濾膜，正置載玻片上，計數。觀察中央和上下左右各5個視野的侵入濾膜細胞數，取均值。侵襲活性抑制率=(對照組侵入濾膜細胞數-ASPS組侵入濾膜細胞數)/對照組侵入濾膜細胞數×100%。

1.5Western blotting法測定HT-29細胞上清液中bcl-2、bax和Caspase-3蛋白表達水平取HT-29細胞1×105個，培養24 h，加入不同濃度ASPS組血清，處理48 h后，收集細胞。bradford法提取蛋白，將20 μg蛋白加入緩沖液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，室溫下PBS-T洗膜3次，分別加入1∶200稀釋一抗4℃孵育過夜，再分別加入1∶1 000稀釋的相應二抗，室溫孵育1 h，室溫PBS-T洗3次，DAB顯色。Imagel凝膠成像系統采集圖像，目的條帶凈灰度值與內參照β-actin測定值的比值即蛋白表達水平。實驗重復3次。

2　結　果

2.1各組HT-29細胞增殖抑制率和侵襲活性抑制率MTT檢測：不同濃度ASPS含藥血清培育72 h后，HT-29細胞株均表現為抑制，200和400 mg·kg-1ASPS組HT-29細胞增殖抑制率均高于對照組和100 mg·kg-1ASPS組(P<0.05或P<0.01)。200和400 mg·kg-1ASPS組HT-29細胞侵襲活性抑制率均高于對照組和100 mg·kg-1ASPS組(P<0.05)。見表1。

表1各組HT-29細胞增殖抑制率和侵襲活性抑制率

GroupInhibitoryrateofproliferationInhibitoryrateofinvasionabilityControl1.02±0.601.71±1.14ASPS(mg·kg-1) 1004.02±2.702.88±1.72 20010.52±5.20*△44.37±18.91*△ 40013.75±3.40**△48.47±26.38*△

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;△P<0.05vs100 mg·kg-1ASPS group.

2.2HT-29細胞上清液中bcl-2、bax和 Caspase-3蛋白的表達免疫印跡法檢測：與對照組比較，400 mg·kg-1ASPS組HT-29細胞上清液中bcl-2蛋白表達水平降低(P<0.01)，200和400 mg·kg-1ASPS組HT-29細胞上清液中bax蛋白表達水平升高(P<0.05)。Caspase-3條帶隨ASPS濃度的增大而明顯變深，與對照組比較，200和400 mg·kg-1ASPS 組HT-29細胞上清液中Caspase-3蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖1和表2。

Lane 1: Control group;Lane 2-4: 100，200，and 400 mg·kg-1ASPS groups.

圖1各組HT-29細胞上清液中bcl-2、bax和 Caspase-3蛋白表達電泳圖

Fig.1Electrophoregram of expressions of bax,bcl-2,and Caspase-3 proteins in supernatant of HT-29 cells in various groups

3　討　論

結直腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤，行切除術后的患者有一半以上會出現復發和遠端轉移，有50%～60%結直腸癌患者表現為進行性肝轉移[6]。除手術治療外，化療所用的常用藥物在殺滅結腸癌細胞同時，也會損害正常細胞，所以對患者傷害較大。ASPS在提高機體的非特異性免疫功能的同時，還可以升高外周血白細胞數，增強機體非特異性免疫功能和體液免疫功能，提高機體的抗癌能力[7]。本實驗觀察了含ASPS血清對HT29細胞的抑制作用，結果顯示：ASPS血清可以明顯抑制人結腸癌HT-29細胞株的增殖，200、400 mg·kg-1ASPS組細胞增殖抑制率分別為10.52%±5.2%、13.75%±3.4%，說明ASPS可以抑制結腸癌HT-29細胞的增殖。

表2各組HT-29細胞上清液中bcl-2、bax和Caspase-3蛋白表達水平

Groupbcl-2proteinbaxproteinCaspase-3proteinControl0.94±0.600.07±0.060.82±0.70ASPS(mg·kg-1) 1000.87±0.500.42±0.040.83±0.40 2000.91±0.700.97±1.03*0.92±0.70* 4000.28±0.50**0.94±0.91*0.98±0.80*

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

惡性腫瘤的最主要標志是侵襲和轉移[8]。脫離原發灶的腫瘤細胞，在黏連蛋白等表面黏附分子的特異性黏附作用下黏附于器官表面，并穿入細胞間隙釋放基質蛋白水解酶，降解局部基質，穿過基底膜后，向周圍間質侵潤性生長，大量增殖成新的腫瘤[9]。腫瘤細胞侵襲轉移最先到達的就是細胞基底膜。Transwell小室模型中，腫瘤細胞穿過基質凝膠，到達另一側，計算其數量，可反映其侵襲活性[10-11]。本實驗采用Transwell小室做為模型，觀察ASPS含藥血清對HT-29細胞體外侵襲活性的抑制作用，結果表明：ASPS含藥血清可以明顯抑制HT-29體外侵襲基底膜Matrigel成分，其抑制率高于對照組，說明ASPS對結直腸癌HT-29細胞的轉移有抑制作用。

bcl-2基因家族主要作用于細胞線粒體[12]，其中bcl-2抑制細胞凋亡，bax促進細胞凋亡，兩者功能相反卻共同參與著細胞凋亡，bcl-2/bax比值是影響細胞凋亡的關鍵因素[13]。bcl-2家族蛋白與蛋白酪氨酸磷酸酶結合，開放線粒體膜轉運孔通道，釋放大量細胞色素C，結合細胞凋亡激活因子Apaf-1，使Caspase-9前體活化，促使Caspase-3激活，引發Caspases 級聯反應，從而誘發細胞凋亡[14-15]。本研究中Western blotting結果表明：HT-29細胞在ASPS含藥血清處理下，上清中bcl-2蛋白表達條帶變窄、變淺，bax蛋白表達條帶明顯變寬、變深，說明bax基因的表達產物隨ASPS濃度的升高而表達增加，bcl-2基因的表達產物水平隨之降低。同時，Caspase-3蛋白表達水平也隨著ASPS濃度升高而升高。說明ASPS可能通過調節HT-29細胞凋亡相關基因，使bax基因的表達上調，bcl-2表達下調，激活Caspase凋亡通路，而誘導腫瘤細胞凋亡。

綜上所述，ASPS對腫瘤細胞的侵襲轉移有明顯的抑制作用，并可誘導細胞凋亡，這為臨床開發新的抗腫瘤藥物提供了理論依據，其具體機制有待于進一步研究。

[1]陳雯，劉寶瑞.五味子多糖的抗腫瘤研究進展[J]．中醫臨床研究，2012，14(4)：24-25.

[2]黃曉東.五味子和桔梗多糖對人結直腸癌CD133+/CD44+細胞生物學行為的影響[D].長春：吉林大學，2012.

[3]許珂玉，肖建英.五味子多糖對甲狀腺癌細胞株SW579凋亡及survivin表達的影響[J]．吉林大學學報：醫學版，2011，37(2)：279-283.

[4]牟遇霖.五味子抗腫瘤的研究狀[J]．中醫中藥，2010，7(2)：84-86.

[5]王艷杰，吳勃巖，孫陽，等.五味子粗多糖對H22、S180荷瘤小鼠抑制作用的實驗研究[J].中醫藥信息，2007，24(5)：64-65.

[6]Speidel D.Transcription-independent p53 apoptosis：an alternative route to death[J].Trends Cell Biol，2010，20(1):14-24.

[7]Taira N， Nihira K， Yamaguchi T，et a1.DYRK2 is targeted to the nucleus and controls p53 via Ser46 phosphorylation in the apoptotic response to DNA damage[J].Mol Cell，2007，25(5):725-738.

[8]孟天嬌，姜亞磊，閆曉英，等.五味子多糖對人腦膠質瘤細胞凋亡的影響[J].吉林醫藥學院學報，2014，35(4)：254-257.

[9]Denault JB, Salvesen GS.Apoptotic caspase activation and activity[J].Methods Molecul Biol，2008，414(5):191-220.

[10]Dewson G，Kratina T， Czabotar P，et al.Bak activation for apoptosis involves oligomerization of dimers via their alpha 6 helices[J].Mol Cell，2009，36(4):696-703.

[11]黃子明.肝腫瘤細胞內Sox17基因mRNA的表達水平與細胞遷移、侵襲力的相關性研究[D].合肥：安徽醫科大學，2013.

[12]陸兔林，吳楊，季德，等.五味子多糖提取分離和藥理作用研究進展[J].中國中藥雜志，2014，39(4)：751-754.

[13]He J，Zhang WY，Zhou QQ，et al.Low- expression of microRNA-107 inhibits cell apoptosis in glioma by upregulation of SALL4[J]． Int J Biochem Cell Biol，2013，45(9)：1962-1973．

[14]Yang K，Liu YS，Liu ZX，et al．p38γ overexpression in gliomas and its role in proliferation and apoptosis[J]．Sci Rep，2013，12(3):2089．

[15]O’Brien CA，Kreso A，Dick JE．Cancer stem cells in solid tumors: an overview [J]．Semin Radiat Oncol，2009，19(2)：71-77．

Inhibitory effects ofAlkalineS.chinenispolysaccharides on proliferation and invasion abilities of colon cancer HT-29 cellsinvitro

HUANG Xiaodong1,LU Qian1,SHEN Nan2,WANG Yanchun1

(1.Department of Pharmacology,Jilin Medical College,Jilin 132013,China;2.Function Experiment Center, Jilin Medical College,Jilin 132013,China)

ObjectiveTo investigate the effect ofAlkalineS.chinenispolysaccharides(ASPS) on the proliferation and invasion abilities of the human colon cancer HT-29 cells,and to clarify the anti-tumor effect of ASPS.Methods40 Wistar rates were randomly divided into control group(n=10,given saline),and 100,200,400 mg·kg-1ASPS groups(n=10),respectively.The serum of the rats in various groups were gotten.The HT-29 cells were treated with the serum of the rats in various groups. The inhibitory rates of proliferation and invasion abilities were tested by MTT and Transwell assay;the expression levels of bcl-2,bax,and Caspase-3 proteins in the supernatant of the cells of the rats in various groups were determined by Western blotting method.ResultsCompared with control group,the inhibitory rates of proliferation and invasion abilities of the HT-29 cells in 200 and 400 mg·kg-1ASPS groups were increased(P<0.05,P<0.01).The expression level of bcl-2 protein in 400 mg·kg-1ASPS group was lower than those in other groups (P<0.05),while the expression levels of bax and Caspase-3 proteins were higher than those in control group(P<0.05,P<0.01).ConclusionASPS can inhibit the proliferation and invasion abilities of the human colon cancer HT-29 cells,and its mechanism may be related to down-regulating the expression of bcl-2 protein and up-regulating the expressions of bax and Caspase-3 proteins,thus activating the apoptotic pathway of HT-29 cells.

colon cancer；AlkalineS.chinensispolysaccharides； invasive ability； apoptosis

1671-587Ⅹ(2015)02-0287-04

10.13481/j.1671-587x.20150215

2014-08-26

吉林省教育廳“十二五”科研項目資助課題(2014547)

黃曉東(1978-)，男，遼寧省撫順市人，講師，醫學博士，主要從事腫瘤藥理學方面的研究。

王艷春，教授，碩士研究生導師(Tel：0432-64560470，E-mail：wangyanchun1972@163.com)

R730.52；R735.3

A