矽肺觀察對象早期蛋白標志物的研究

繆榮明 丁幫梅 張穎軼 吳為民 房中華 趙銳 夏倩 李永

矽肺觀察對象早期蛋白標志物的研究

繆榮明 丁幫梅 張穎軼 吳為民 房中華 趙銳 夏倩 李永

目的 本研究的目的主要集中在矽肺觀察對象與非接塵健康正常人之間蛋白組表達譜的變化分析，探索矽肺發展的早期蛋白標志物。方法 收集矽肺觀察對象組和健康正常人組樣本各10例，利用雙向電泳檢測篩選差異表達的蛋白，然后進行質譜鑒定分析。結果 與非接觸粉塵比較，表達差異在兩倍以上的39個上調蛋白和7個下調蛋白被成功鑒定出來。在矽肺觀察對象組下調的蛋白有轉化生長因子β前體、二肽基肽酶1、載脂蛋白A-Ⅳ前體等蛋白；上調的蛋白有干擾素β前體、腫瘤壞死因子、弗林蛋白酶原、脫氧核糖核酸酶Ⅱ、糖蛋白、顆粒酶A、趨化因子受體等蛋白因子。結論 這些顯著變化的蛋白因子主要參與免疫調控、細胞毒性、物質代謝等過程，可能通過免疫反應和蛋白酶活性在矽肺的早期發展中起重要作用。研究結果為矽肺早期臨床診斷提供了一些潛在的蛋白分子靶點，有助于矽肺早期標志物的進一步研究和應用。

觀察對象；職業疾?。焕w維化；細胞因子；蛋白標志物

矽肺是由于吸入游離的二氧化硅而引起的肺部組織彌漫性纖維化為特征的職業疾病。一旦經臨床胸片確診，肺部的損傷便無有效藥物恢復。而且矽肺觀察對象更容易發生肺癌及其他疾病，是危害最嚴重的職業病之一?；钚匝跷镔|(ROS：reactive oxygen species)、活性氮物質(RNS：reactive nitrogen species)、細胞凋亡相關因子、細胞因子等參與矽肺的發生和發展[1-2]。

二氧化硅顆粒進入肺部細胞后，肺部的細胞和分子機制發生顯著的變化[3]，低劑量(密度)顆?？梢哉T發可逆的炎癥損傷；高密度的顆?？梢詫е麻L時的炎癥反應、細胞增殖、胞外基質及膠原的沉積[4]。多種細胞包括肺泡巨噬細胞(AM：alveolar macrophages)、中性粒細胞(neutrophils)、T淋巴細胞(T-lymphocytes)及肥大細胞參與其中。這些細胞間的信息交流在矽肺的發病過程中起著重要作用。肺泡Ⅰ型表皮細胞不僅參與早期的纖維化，在纖維化的修復和再生中也具有重要作用[5]。吸入二氧化硅后可促進ROS的產生。ROS介導矽肺中的細胞損傷和纖維化中的即刻的和持續的炎癥反應。而活化的炎性細胞會促進氧化物的釋放[6]。在肺泡巨噬細胞中，ROS和RNS參與纖維化的信號通路[7]。氧化物質所起作用復雜，可誘導炎癥相關的細胞信號級聯反應，從而在纖維化中起重要作用。

生長因子和細胞因子包括轉化生長因子、白介素等在矽肺的發展過程中表達發生顯著變化，且在纖維化過程中起重要作用。在AM中，血小板衍生生長因子(PDGF：Platelet derived growth factor)在成纖維細胞增殖過程與轉化生長因子β交互作用[8]。表皮生長因子和轉化生長因子在肺部表皮細胞有絲分裂和成纖維化過程中起著關鍵作用，激活相關的信號通路。腫瘤壞死因子和白介素1的表達早于炎癥反應和纖維化，能夠通過T或B淋巴細胞增殖和活化等過程刺激炎癥和免疫反應[9]。二氧化硅可通過腫瘤壞死因子啟動子促進腫瘤壞死因子的表達[10]。

由于矽肺的發病機制未完全清楚，細胞內信號傳導的復雜性和矽肺觀察對象個體不同狀態，矽肺的治療變得尤為困難。而矽肺觀察對象一旦確診，肺部損傷便無有效藥物逆轉。為了探索矽肺早期的診斷標志物，本文選取矽肺觀察對象樣本和非接觸粉塵樣本，采用雙向電泳和MALDI-TOF-MS質譜分析方案，篩選差異表達的蛋白，并進行鑒定及分析，以期發現有意義的蛋白標志物。

1 對象與方法

1.1 對象 某酒店服務員人員10例為非接觸粉塵健康對照組，年齡32.4～59.1歲，平均(41.6±3.7)歲，工齡6.1～10.9年，平均(7.9±1.5)年；被集體診斷為觀察對象者10例為實驗組(清砂工6例、型砂工4例)，年齡33.1～56.5歲，平均(42.2±4.1)歲，工齡6.9～10.7年，平均(8.2±1.3)年；兩組對象均為男性，年齡、工齡比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。收集實驗組和健康對照組全血2 mL，每組3重復，每個重復來源于10例矽肺觀察對象或健康個體的混合，該研究獲得倫理委員會許可且所有樣本組人員均接受知情同意書。兩組對象全部剔除高血壓病、糖尿病、心臟病、血液病、風濕免疫系統疾病、腫瘤、腎臟病、肝臟病等矽肺觀察對象。全部受檢對象均未從事過各類輻射和有毒作業，也無長期接觸過各類農藥和毒物，營養和消化吸收功能良好，在受檢前1個月內均未服用維生素C、銀杏葉制劑和茶多酚等抗氧化藥物。兩組之間年齡差異無統計學意義。所有血樣置于4℃冰箱24 h，然后樣本轉移到離心機(型號：5418R，品牌：Eppendorf)于4 000 rpm速度下離心10 min取血清，保存于－80℃待用。

1.2 蛋白提取和高豐度蛋白去除 矽肺觀察對象和健康對照組樣本總蛋白根據三氯乙酸的方法(trichloroacetic acid method)[11]。去高豐度蛋白去除試劑(Agilent human 14 multiple affinity removal system columns：albumin、IgG、antitrypsin、IgA、transferrin、haptoglobin、fibrinogen、alpha2-macroglobulin、alpha1-acid glycoprotein、IgM、apolipoprotein AI、apolipoprotein AII、complement C3和transthyretin)，進行處理總蛋白樣本。得到富集低豐度蛋白，有利于進一步的蛋白組學分析，從而提高雙向電泳和質譜的分辨率及動態范圍。樣本依次用裂解液(9 mol/L urea，4%CHAPS，65 mmol/L dithiothreitol and cocktail enzyme inhibitor)溶解及定量。

1.3 雙向電泳 先進行第一相電泳(等電聚集isoelectric focusing，IEF)，將樣品液和水化液混和后總體積450 μL加入膠槽中，放入膠條后加覆蓋液。等電聚焦條件為：30 V 6 h；60 V 6 h；500 V 1 h；1 000 V 1 h；8 000 V 20 h，等電聚焦達到64 000 Vhr后結束。然后進行第二相電泳(十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，SDS-PAGE)，膠條平衡后進行凝膠的灌制，灌制濃度為12.5%的聚丙烯酰胺凝膠。將平衡完畢的凝膠放置第二相凝膠的頂部；用低熔點瓊脂糖封膠液后進行第二相電泳。以恒功率進行電泳(Ettan DALT SIX垂直電泳儀)，每膠4 W電泳45 min，然后每膠15 W直至溴酚藍前沿泳至凝膠的底部。硝酸銀染色后，置凝膠于掃描儀掃描(瑞典Amersham Bioscience公司)，用ImageMaster 2D Platinum軟件(美國GE公司)進行凝膠的數據分析。按照P值小于0.05和差異倍數為2倍以上為標準篩選分析差異表達的蛋白點。

1.4 MALDI-TOF-MS質譜分析 取出的點放入96孔板中，加入ddH2O超聲5 min。加乙腈50 μL，脫水至膠粒完全變白，真空抽干5 min。加入10 mM DTT/25 mM NH4HCO350 μL，56 ℃水浴1 h。然后冷卻至室溫后，吸干，加入55 mM碘乙酰胺/25 mM NH4HCO350 μL，避光45 min。依次用25 mM NH4HCO3，50%乙腈洗，脫水到膠粒完全變白，真空抽干5 min。加胰酶儲液冰上放置30 min，加NH4HCO3覆蓋膠粒，37℃水浴12 h，加入0.1%TFA，終止酶解反應。樣品及標準品1 μL點于AutoflexⅡMALDI-TOF/TOF質譜儀靶上，干燥后點少許基質，進行質譜檢測。得到肽質量指紋譜(Peptide Mass Fingerprint，PMF)用Flexanalysis 3.0軟件處理，肽段檢測算法為SNAP算法，信噪比(S/N)的域值為1.5。肽質量指紋譜用Matrixscience網站提供的Mascot搜索引擎進行數據庫檢索[12]。

1.5 統計學分析 矽肺觀察對象組和對照組之間差異表達的蛋白利用T-test方法進行比較分析(SPSS V20)。將差異表達的蛋白序列導入軟件Blast2GO(V2.7.2)，分析蛋白序列，進行功能注釋并GO豐度分析[13]。

2 結果

2.1 蛋白表達譜 來源于矽肺觀察對象組和健康對照組的血清樣本經雙向電泳和MALDI-TOF/TOF質譜鑒定分析后，46個差異2倍以上(P＜0.05)蛋白鑒定出來(表1)。相比非接觸粉塵，在矽肺觀察對象組有39個蛋白上調，7個蛋白下調(表1，圖1A～B)。這些蛋白主要為細胞因子、載脂蛋白、酶類等蛋白因子。

2.2 蛋白GO功能分析 在矽肺觀察對象組和健康對照組中差異表達的蛋白利用軟件Blast 2GO進行功能注釋和分析[14]。對鑒定出的蛋白按照3大類功能進行富集分析，包括生物學處理、細胞組分和分子功能。從分子生物功能類別看，在矽肺觀察對象組和健康對照組中差異表達的蛋白主要參與離子結合、酶活性等分子生物學功能。其中前5名的富集功能為離子結合，信號轉導活性，酶調節活性，肽酶活性和酶結合(圖2A)。從生物學過程的分類分析，這些差異表達的蛋白主要參與信號轉導、免疫反應、細胞分化等生物過程。排列前6名的功能類別為信號轉導，壓力反應，免疫系統過程，解剖結構的發展，細胞分化和細胞死亡(圖2B)。通過細胞組分類別的富集分析，排列前6名的為胞外區，細胞器，質膜，蛋白復合體，細胞組分和內質網(圖2C)。

表1 矽肺早期(觀察對象組)與健康對照組差異表達的蛋白

圖1 來源于矽肺觀察對象組和健康對照組的血清樣本經雙向電泳IPG(17 cm，pH 3-10L)和垂直電泳分析的掃描結果圖。A：在矽肺觀察對象組中高表達的蛋白；B：在健康對照組中高表達的蛋白

圖2 矽肺觀察對象組與健康對照組之間差異表達的蛋白利用GO功能分析后的功能富集圖。A：差異表達的蛋白在分子生物學功能類別中的功能富集分析圖；B：差異表達的蛋白在生物學處理過程中的功能富集分析圖；C：差異表達的蛋白在細胞組分中的功能富集分析圖

3 討論

矽肺是因吸入二氧化硅顆粒而引起的嚴重的肺部功能性損傷，表現為持續的炎性反應和肺部彌漫性纖維化。觀察對象短期接觸高濃度的粉塵或低濃度長期接觸的職業性危害因素，當時無明顯臨床表現或僅有輕度相應的癥狀而未能確診為職業病，需作進一步醫學監護。目前矽肺的發病機制仍不清楚，并且在發展早期缺少有效的檢測手段。我們通過研究矽肺觀察對象組與非接觸粉塵之間的蛋白譜變化，從而初步探索矽肺早期診斷標志物。

細胞因子是一大類由免疫細胞釋放的蛋白分子，參與細胞信號調控、免疫反應過程。本研究發現多種細胞因子在矽肺觀察對象組中高表達，例如干擾素β前體、腫瘤壞死因子等(圖1A，表1)。腫瘤壞死因子、白介素、干擾素及轉化生長因子在肺部組織纖維化中起重要作用，這些相關細胞因子的持續表達可活化成纖維細[4，15-16]。本研究發現腫瘤壞死因子、干擾素β前體、突變IL-17F在矽肺觀察對象組中高表達(圖1，表1)。干擾素γ和致炎癥劑例如IL-10能夠刺激上調一氧化氮的產生[17]，ROS和RNS誘導肺部表皮細胞炎性損傷[4]。IL1及腫瘤壞死因子能夠刺激多種炎癥和免疫反應例如T細胞增殖、活化及炎性細胞脫粒。腫瘤壞死因子受體超家族13B基因(TNFRSF13B)翻譯的蛋白主要在一些B細胞亞組表面表達，結合TNF受體后具有B淋巴細胞分化調控功能，在體液反應過程中發揮重要作用[18-19]。TNFRSF13B編碼變化與免疫缺陷密切相關，促進疾病的發生。腫瘤壞死因子13B variant(TNFR13BV)在矽肺觀察對象組中高表達，提示TNFR13BV可能參與矽肺的發生過程中的免疫反應，起著重要的作用。趨化因子是一類單鏈小分子的蛋白質超家族，在多種免疫和炎癥反應中起著關鍵作用。非典型趨化因子受體不偶聯經典G蛋白信號通路，但可有效地內化同源趨化因子配基并使其降解[20]。這些在矽肺觀察對象組中表達上調的蛋白可能參與炎癥的起始和維持，并啟動成纖維細胞的活化，在矽肺的早期發展中扮演重要的角色。

白介素1受體輔助蛋白(IL1AR1)在白介素33誘導的T淋巴細胞和肥大細胞的活化中起著重要作用。白介素1受體輔助蛋白也參與X聯鎖智力低下與神經鈣感應1相互作用的過程[21-22]。X聯鎖白介素1受體輔助蛋白樣2(IL1RAPL2)參與X聯鎖的神經退化[23]，與健康對照組相比較，IL1RAPL2在矽肺觀察對象組中表達水平升高(表1)，說明其可能在矽肺的早期發展過程中有調節神經信號通路的作用。相對非接觸粉塵，人生長激素胞外區受體在矽肺觀察對象組中表達上升(圖1，表1)。生長激素結合受體后通過相關的信號傳導調節生長和發育[24]。生長激素胞外區受體可能通過正調控多細胞機體、AK或JAK-STAT級聯調控的生長激素信號通路參與矽肺早期的發展。

角蛋白Ⅱ型表皮Hb4(KRT4)是由角蛋白基因家族編碼參與細胞骨架的結構組成、角質形成細胞分化等過程。角蛋白Ⅱ型表皮Hb4在類風濕自身免疫疾病中高表達[25]。本研究發現KRT4在矽肺觀察對象組中高表達(表1，圖1)，提示其可能參與矽肺疾病的早期發展。

載脂蛋白通過淋巴和血液循環系統運輸脂類物質，并且參與脂類蛋白的代謝調控。載脂蛋白A-Ⅳ前體在矽肺觀察對象組中表達水平下調(表1，圖1)，說明該蛋白的表達變化可能與矽肺早期的脂類代謝改變有一定關系。載脂蛋白A-Ⅳ基因與A-Ⅰ和C-Ⅲ相連，位于A-Ⅰ下游14kb位置，研究表明3個基因有一定的調控關系[26]。載脂蛋白A-Ⅳ參與調控多種代謝通路包括脂類吸收、轉運及代謝，在預防動脈粥樣硬化中有重要作用。該蛋白可能受營養物質、膽道復合體、藥物、激素等因子的影響。此外，載脂蛋白A-Ⅳ前體也在自身免疫疾病如類風濕性關節炎中表達升高[27]。

糖蛋白(glycoprotein)是由共價相連的分支寡糖鏈和多肽鏈構成的復合糖，具有生物識別、信號在細胞間傳遞等功能。KL-6(Krebs von den lungen-6)是第9族肺組織細胞抗原的高分子量糖蛋白，主要位于Ⅱ型肺泡上皮細胞等處，是重要的纖維化肺疾病的標志物[28]。KL-6在小氣道上皮細胞襯液表達水平上調可引起纖維化肺部疾病的肺泡內纖維化[29]。本研究發現α1B糖蛋白和T4表面糖蛋白前體在矽肺觀察對象組顯著上調(表1，圖1)。α1B糖蛋白參與多種疾病如子宮內膜癌、宮頸癌等[30-31]。該蛋白在肝纖維化矽肺觀察對象表達上調，且可作為無創診斷區分健康患病的手段[32]。T4表面糖蛋白前體參與T細胞共刺激、正調控白介素2生物合成過程、T細胞受體復合物、胞外機制結構組成、先天性免疫反應、轉膜受體蛋白酪氨酸酶信號通路等。α1B糖蛋白和T4表面糖蛋白前體在矽肺觀察對象組中的顯著上調提示該兩類蛋白可能通過生物識別、纖維化信號通路的刺激等方式參與矽肺早期的發展，可考慮深入研究作為矽肺早期診斷標志物的可行性。

顆粒酶具有絲氨酸蛋白酶活性，由毒性T細胞及自然殺傷細胞的胞質粒分泌。顆粒酶A可導致細胞凋亡或死亡、線粒體內膜減少及ROS的釋放。受ROS刺激，內質網相關SET復合體轉移到細胞核后，顆粒酶A剪切參與DNA修復的SET復合體的三個組分[33]。顆粒酶A可能影響核纖層蛋白和組蛋白H1，這對核膜穩定性和染色體結構維持有重要意義，有利于DNA酶活性[33]。在特發性肺部纖維化矽肺觀察對象和博來霉素處理后的小鼠單核細胞浸潤淋巴細胞中發現顆粒酶B表達上調[34]。本研究結果中顆粒酶A在矽肺觀察對象組中表達水平升高(表1)，提示顆粒酶A有可能通過影響T細胞增加和活化而提高細胞毒性對抗二氧化硅吸入后的反應，在矽肺發展的早期有重要作用。

組織蛋白酶G屬于絲氨酸酶類，是嗜天青顆粒蛋白重要組成部分，在炎癥的嗜中性功能中起著重要作用，降解胞外基質組分和細胞因子等。組織蛋白酶G可能是維持嗜中性介導的急性組織病理極其缺血腎臟再灌注損傷后的纖維化重要組成部分[35]。本研究發現組織蛋白酶G鏈B在矽肺觀察對象組中表達水平升高(表1)，說明組織蛋白酶G可能在矽肺發展的早期參與免疫反應，是一個潛在的早期診斷標志物。

弗林蛋白是存在于真核生物細胞中一種重要的內切蛋白酶，具有重要的生物學功能，參與多種疾病的發生和發展。該酶在內質網-高爾基體中經兩次自剪切活化后，能夠識別特定的氨基酸序列，對分泌過程中多種重要的蛋白及多肽前體進行剪切加工，使之具有生物活性[36]。弗林蛋白酶有多種類型的底物，包括生長因子、蛋白受體、基質金屬蛋白酶、黏附分子及某些病毒包裝糖蛋白等。基質金屬蛋白酶有助于急性和慢性矽肺發生，并且基質金屬蛋白酶的失衡可能導致胞外基質重建以及基底膜的破壞[37-38]。弗林前蛋白原在矽肺觀察對象組中表達升高(相對健康對照組)，可能通過對相關蛋白的選擇性剪切修飾參與矽肺的早期發生。弗林蛋白在矽肺的早期診斷上有潛在的參考和應用價值。

綜上所述，本研究發現α1B糖蛋白和T4表面糖蛋白前體在矽肺觀察對象組中高表達，可能參與胞外基質的構建和免疫反應的調控。絲氨酸蛋白酶相關的顆粒酶A在矽肺觀察對象組中表達升高，可能通過T細胞的活化等過程影響矽肺早期的細胞毒性和外源物的清除。二氧化硅長期吸入后，組織蛋白酶G和弗林前蛋白原在矽肺觀察對象組表達量升高，可能參與早期的蛋白或多肽的剪切等過程，從而影響一系列的免疫反應。多種細胞因子如腫瘤壞死因子、干擾素β前體、白介素6等在矽肺觀察對象組中表達上升，可能直接參與免疫反應和調控，并且在持續的免疫反應中起維持作用。本研究中的蛋白表達譜在矽肺觀察對象組和健康對照組中的顯著變化的結果為早期矽肺發展機制提供了蛋白譜研究基礎，為矽肺早期的臨床診斷提供了多種潛在的蛋白標志物。

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Objective To study mainly the change analysis of proteomic expression profile between silicosis objects of observation and healthy people，so as to investigate the protein biomarkers of silicosis in early stage.Methods 10 samples from observation objects of silicosis and 10 healthy people were collected and performed by two-dimensional electrophoresis to screen protein with differential expression，and then mass spectrum identification was analyzed.Results Compared with non-dust contact healthy people，39 up-regulated proteins and 7 down-regulated proteins with more than twice of differential expression were successfully identified.In observation objects of silicosis，down-regulated proteins showed transforming growth factor βprecursor，dipeptidyl peptidase 1，and apolipoprotein A-Ⅳ precursor，and up-regulated proteins showed interferon β precursor，tumor necrosis factor，Furin proteinase，deoxyribonuclease Ⅱ ，glycoprotein，granzyme A and chemokine receptor.Conclusion These differently expressed protein factors are mainly involved in immune regulation，cytotoxicity，and metabolism，which plays an important role in the early development of silicosis through immunoreaction and proteinase activity.The results provide some potential protein molecular targets for early clinical diagnosis of silicosis，which are helpful for further study and application of markers of silicosis in early stage.

Observation objects；Occupational disease；Fibrosis；Cell factor；Protein markers

2015-07-18)

1005-619X(2015)09-0906-07

10.13517/j.cnki.ccm.2015.09.003

214000 無錫市第八人民醫院(繆榮明，張穎軼，吳為民，房中華，趙銳)；214000 江蘇省疾病預防控制中心(丁幫梅)；214000 無錫市慈善醫院(夏倩，李永)

江蘇省委組織部333人才基金項目(BRA2013041)；江蘇省六大人才高峰資助項目(2014-WSN-063)；無錫市科技發展資金項目(CSE31N1327)

繆榮明