腦苷肌肽對APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠腦內β-淀粉樣蛋白42和鈣結合蛋白-D28K表達的影響

胡亞卓，高 雅，韓志濤，夏 征，耿 艷，李瑞生，陳紅艷，王建華，張紅紅，王魯寧

1解放軍總醫院 老年醫學研究所衰老與相關疾病北京市重點實驗室，北京 100853；2解放軍第302醫院實驗動物中心，北京 100039

腦苷肌肽對APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠腦內β-淀粉樣蛋白42和鈣結合蛋白-D28K表達的影響

胡亞卓1，高 雅1，韓志濤1，夏 征1，耿 艷1，李瑞生2，陳紅艷1，王建華1，張紅紅1，王魯寧1

1解放軍總醫院 老年醫學研究所衰老與相關疾病北京市重點實驗室，北京 100853；2解放軍第302醫院實驗動物中心，北京 100039

目的 觀察腦苷肌肽（cattle encephalon glycoside and ignotin injection，CEGI）對APPswe/PS1dE9雙轉基因癡呆模型小鼠腦內β-淀粉樣蛋白42（amyloid β-peptide，Aβ42）和鈣結合蛋白-D28K（calbindin-D28K，CB）表達的影響，探討CEGI對阿茨海默病（Alzheimer's disease，AD）的防治作用。方法 APPswe/PS1dE9雙轉基因AD模型小鼠共48只，隨機分為腦苷肌肽低劑量組［Tg + CEGI-L組，腹腔注射CEGI 6.6 ml/（kg·d）］、高劑量組［Tg + CEGI-H組，腹腔注射CEGI 13.2 ml/（kg·d）］、陽性藥鹽酸多奈哌齊組［Tg + Donepezil組，Donepezil灌胃2 mg/（kg·d）］，模型組（Tg組，腹腔注射等體積0.9%氯化鈉注射液），每組12只；同月齡同背景非轉基因野生型C57BL/6J小鼠12只作為正常對照組（nTg組，腹腔注射等體積0.9%氯化鈉注射液）。小鼠自5月齡開始腹腔注射給藥1個月，然后進行Morris水迷宮實驗檢測小鼠的學習記憶能力，硫黃素S熒光染色和免疫組織化學染色檢測皮質區Aβ42表達，免疫組織化學染色檢測海馬CA1區及CA3區CB表達的變化。結果 行為學實驗，與Tg組比較，Tg + CEGI-L組小鼠空間學習和記憶能力有明顯改善（P＜0.05）；小鼠大腦皮質Aβ42的表達數目在Tg組顯著高于Tg + CEGI-L組和Tg + CEGI-H組（43.00±10.03 vs 24.63±10.61/24.89±6.81，P＜0.05）；小鼠海馬CA1區神經元保護性蛋白CB在Tg + CEGI-L組顯著高于Tg組（0.056±0.023 vs 0.031±0.001，P＜0.05）。結論 CEGI能抑制Aβ42在大腦中的聚集沉積、CB過表達來降低神經元損傷，進而改善APPswe/PS1dE9雙轉基因癡呆模型小鼠的學習記憶能力。

腦苷肌肽；阿爾茨海默病；APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠；β-淀粉樣蛋白42；鈣結合蛋白-D28K

網絡出版時間：2015-04-20 10:24 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150420.1024.001.html

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是神經退行性疾病，主要病理改變為β-淀粉樣蛋白（amyloid β-peptide，Aβ）沉積和老年斑（senile plaque，SP）形成、神經原纖維纏結（neurofibrillary tangle，NFT）、腦淀粉樣血管?。╟erebral amyloid angiopathy，CAA）及顆粒狀空泡小體（granular vacuolar bodies）等［1-2］，其發病機制復雜，目前公認的主要機制是Aβ沉積、膽堿能系統受損、自由基代謝紊亂等［3］。其中Aβ產生在AD中起著非常重要的作用，主要認為Aβ在患者腦內過量產生和聚集引發了病理級聯反應，最終導致神經元功能紊亂并死亡，從而引起病理性癡呆［4-5］。鈣結合蛋白-D28K（Calbindin D28K，CB）是主要存在于腦內的鈣結合蛋白之一，主要存在于細胞質、軸突及某些腦區神經元的樹突中。有研究顯示，神經元生物標記物CB可結合神經元內的鈣，維持鈣穩態而使神經元細胞免受鈣濃度過高的毒性作用，減少SP形成，從而起到保護神經元的作用，神經元CB表達的降低與AD及神經退行性變具有相關性［6-9］。APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠模型，能模擬AD腦內Aβ的沉積和老年斑形成，對AD的早期研究有重要應用價值，是國際公認的AD動物模型［10］。腦苷肌肽（cattle encephalon glycoside and ignotin injection，CEGI）為小分子多肽氨基酸和多種神經節苷脂成分，對促進神經再生和恢復神經功能有重要作用，已在臨床上廣泛應用于腦卒中、老年癡呆和腦損傷等心腦血管疾病的治療，且療效確定［11］。我們假設CEGI的神經保護作用可能與CB有關。本研究以APPswe/PS1dE9雙轉基因AD小鼠為模型，觀察CEGI對小鼠腦內Aβ形成和與神經元變性密切相關的CB表達的影響。

材料和方法

1 實驗動物 APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠48只，同月齡同背景非轉基因野生型C57BL/6J小鼠12只，均為雄性5月齡，體質量平均32.5g，相關基因APP、PS1，均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號SCXK（京）2009-0004。在解放軍第302醫院實驗動物中心SPF級動物房單籠飼養，自由飲食。

2 實驗藥物與試劑 CEGI由吉林四環制藥有限公司提供［批號：20121223，2 ml/支］，鹽酸多奈哌齊片［衛材（中國）藥業有限公司，批號：120649A，5 mg/片］作為陽性對照藥。小鼠抗Aβ1-42抗體（DaKo公司）；小鼠抗CB抗體（Sigma公司）；硫黃素S（Thioflavin-S，Sigma公司）；免疫組織化學試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

3 主要儀器 全自動脫水機（ASP 200）、組織包埋機（EG1140H）、石蠟切片機（RM 2135）及冷凍切片機（CM1900）均為德國Leica公司產品；BX60熒光顯微鏡、顯微成像系統及圖像分析系統IPP 5.1均為日本OLYMPUS公司產品。

4 實驗動物分組與給藥 APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠隨機分為4組：轉基因模型對照組（Tg組）、腦苷肌肽低劑量組（Tg + CEGI-L組）［6.6 ml/（kg·d），腹腔注射］、腦苷肌肽高劑量組（Tg + CEGI-H組）［13.2 ml/（kg·d），腹腔注射］及陽性藥物多奈哌齊組（Tg + Donepezil組）［鹽酸多奈哌齊2 ml/（kg·d），灌胃］。C57BL/6J小鼠12只作為正常對照組（nTg組）和Tg組均給予腹腔注射等體積0.9%氯化鈉注射液，1次/d。連續給藥1個月后，進行相關指標測試。

5 Morris水迷宮測試 給藥4周后，對各組進行Morris水迷宮實驗，檢測小鼠學習記憶能力：1）定位航行實驗：每只小鼠每天訓練4次，連續進行5 d。每次實驗小鼠游泳尋找隱藏平臺的時間最多為60 s。如果超出60 s小鼠仍然沒有找到平臺，則將小鼠引導到平臺上。動物找尋并爬上平臺的時間被定為潛伏期。2）空間探索實驗：最后一次學習實驗結束后24 h，移除平臺進行探索實驗，用以檢測記憶能力。探索實驗中，采用新的起始位置，每次實驗時間為60 s。在探索試驗中，以動物在目標象限停留時間評估學習任務的優劣。

6 腦組織樣品制備 小鼠于Morris水迷宮全部測試后，禁食12 h，不禁水，進行腦組織取材。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，從左心室快速輸注0.9%氯化鈉注射液，并迅速剪開充盈的右心耳，此時會有大量血液涌出，灌注時間為3 ～ 5 min，直至流出清亮液體為止。于低溫下快速斷頭取全腦，腦組織稱重，右側腦組織放入4%多聚甲醛溶液固定24 h以上（4℃），常規石蠟包埋切片；分離左側海馬和皮質，置液氮中速凍后保存于-70℃冰箱，待作生化和基因表達檢測。

7 免疫組織化學測定大腦皮質Aβ42及海馬CB免疫組織化學（immunohistochmeistry，IHC）分析Aβ在大腦皮質及CB在海馬CA1區、CA3區的表達。經二甲苯和不同濃度乙醇脫蠟至水，0.01 mol/ L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中微波抗原修復，3%過氧化氫溶液滅活內源性酶，滴加5% BAS封閉，一抗1∶100（Aβ42）及1∶1 000（CB） 4℃過夜，滴加生物素羊抗鼠IgG、ABC復合物，DAB顯色。陰性對照切片不加一抗。硫黃素-S（Thioflavin-S）能與纖維性Aβ表面的Aβ折疊結合，從而可以檢測出老年斑的沉積：1% Thioflavin-S室溫孵育10 min，50%乙醇脫色后封片。光鏡下，每組選取8只小鼠腦的各3張切片，每張切片選取3個不重疊視野，進行Aβ陽性細胞計數；對CB在海馬CA1和CA3區的表達采用Image-Pro Plus 5.1圖像分析系統進行分析，所得數據以平均光密度代表陽性顆粒的強度。

8 統計學處理 采用統計軟件SPSS13.0進行統計分析，所得數據以±s表示，數據經正態分布和方差齊性檢驗，采用單因素方差分析，統計顯著性分析使用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結　果

1 行為學實驗 各組小鼠Morris水迷宮結果顯示，與nTg組比較，Tg組平均逃避潛伏期顯著延長（P＜0.05），目標象限停留時間顯著縮短（P＜0.01）；與Tg組比較，Tg + CEGI-L組平均逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05），目標象限停留時間顯著延長（P＜0.05）；Tg + CEGI-H組目標象限停留時間顯著延長（P＜0.01）；Tg + Donepezil組目標象限停留時間延長，但無統計學差異。見圖1。

2 海馬CA1 HE染色 nTg組海馬CA1細胞排列整齊緊密、分布均勻，結構清晰，Tg組海馬結構細胞層次變少，數量減少，排列紊亂，稀疏，細胞周圍間隙增大。見圖2。

3 硫黃素S熒光檢測大腦皮質老年斑 nTg組小鼠大腦皮質區域未見綠色熒光老年斑塊；Tg組大腦皮質出現較多綠色熒光老年斑塊；而Tg + CEGI-L組、Tg + CEGI-H組和Tg + Donepezil組老年斑塊明顯減少，與Aβ42免疫組織化學的結果一致。見圖3。

4 免疫組織化學檢測大腦皮質Aβ42表達 Aβ42在各組小鼠大腦皮質表達及計數分析免疫組織化學結果顯示，Tg 組大腦皮質出現較多Aβ42沉積；與Tg組比較，CEGI-L組、Tg + CEGI-H組和Tg + Donepezil組Aβ42明顯減少（P＜0.05），免疫組織化學形態學和定量分析結果。見圖4、圖5。

5 CB在各組小鼠海馬CA1和CA3的表達及定量分析 免疫組化結果顯示，與Tg組比較，CB在nTg組和Tg+CEGI-L組小鼠的海馬CA1區表達較強（P＜0.05）；免疫組織化學形態學和定量分析結果。見圖6、圖7。

6 CB在各組小鼠海馬CA3的表達 免疫組化結果顯示，與Tg組、Tg + CEGI-H組、Donepezil組比較，CB在nTg組小鼠的海馬CA3區表達較強（P＜0.05）；與Tg組、Tg + CEGI-H組、Donepezil組比較，CB在Tg + CEGI-L組含量高（P＜0.05）。免疫組織化學形態學和定量分析結果。見圖8、圖9。

討　論

圖 1　腦苷肌肽對APP/PS1小鼠學習和記憶能力的改善作用（與Tg組比較，aP＜0.05，bP＜0.01）A： 逃避潛伏期； B： 目標象限停留時間Fig. 1　Effects of CEGI on spatial learning and memory in APP/PS1 mice （compared with Tg group，aP＜0.05，bP＜0.01）A： Escape latency； B： Taget quadrant time

圖 2　各組小鼠海馬CA1 （HE ×400）A：正常對照組； B：轉基因模型對照組； C：腦苷肌肽低劑量組；D：腦苷肌肽高劑量組； E：陽性藥物多奈哌齊組Fig. 2　HE stains for hippocampus CA1 region in each group （HE ×400）A： nTg； B： Tg； C： Tg + CEGI-L；D： Tg + CEGI-H；E： Tg + Donepezil

圖 3　各組小鼠大腦皮質老年斑硫黃素-S熒光染色（×100） A：正常對照組； B：轉基因模型對照組； C：腦苷肌肽低劑量組； D：腦苷肌肽高劑量組； E：陽性藥物多奈哌齊組Fig. 3　Thioflavin S stains of Aβ plaque in the cortex area in each group （×100）A： nTg； B： Tg； C： Tg + CEGI-L； D：Tg + CEGI-H； E： Tg + Donepezil

圖 4　各組小鼠大腦皮質Aβ42老年斑免疫組化染色 （×100） A：正常對照組； B：轉基因模型對照組； C：腦苷肌肽低劑量組；D：腦苷肌肽高劑量組； E：陽性藥物多奈哌齊組圖 5　各組小鼠大腦皮質Aβ42定量分析（與Tg組比較，aP＜0.05）Fig. 4　IHC stains of Aβ plaque expression in the cortex area in each group （×100） A： nTg； B： Tg； C： Tg + CEGI-L ； D： Tg + CEGI-H； E： Tg + DonepezilFig. 5　Quantitative analysis of IHC stains for Aβ42 expression in the cortex area in each group （compared with Tg group，aP＜0.05）

圖 6　各組小鼠海馬CA1區CB免疫組化染色 （IHC×200） A：正常對照組； B：轉基因模型對照組； C：腦苷肌肽低劑量組；D：腦苷肌肽高劑量組； E：陽性藥物多奈哌齊組圖 7　各組小鼠海馬CA1區CB光密度 （與Tg組比較，aP＜0.05）Fig. 6　 IHC stains for CB expression in the hippocampus CA1 region in each group （IHC×200） A： nTg； B： Tg； C： Tg + CEGI-L； D： Tg + CEGI-H； E： Tg+DonepezilFig. 7　Optical density for CB expression in CA1 hippocampal region in each group （compared with Tg group，aP＜0.01）

圖 8　各組小鼠海馬CA3區CB免疫組化染色（IHC×200） A：正常對照組； B：轉基因模型對照組； C：腦苷肌肽低劑量組；D：腦苷肌肽高劑量組； D：陽性藥物多奈哌齊組圖 9　各組小鼠海馬CA3區CB光密度 （與Tg組比較，aP＜0.05）Fig. 8　IHC stains for CB expression in CA3 hippocampal region in each group （IHC×200） A： nTg； B： Tg； C： Tg + CEGI-L；D： Tg + CEGI-H； E： Tg + DonepezilFig. 9　IHC stains for CB expression in CA3 hippocampal region in each group （compared with Tg group，aP＜0.05）

正常情況下，腦組織Aβ的生成以Aβ40為主，而在AD患者腦內Aβ42的生成明顯增多。雖然腦內Aβ42的含量很少，但是其片段最長、毒性最強，比Aβ40更容易聚集沉積，是形成老年斑的主要成分［12-13］。Aβ在腦內異常聚集并纖維化形成SPs，其神經毒性作用可誘發氧化應激、激活小膠質細胞、破壞鈣離子穩態、激活凋亡相關蛋白并導致廣泛的神經元丟失［14-15］。近來研究認為，鈣穩態異常是AD中Aβ形成的關鍵因素，并為AD導致細胞死亡的“最后共同通路”［16］。CB介導的鈣穩態異常與AD密切相關。CB是神經元的標志性、保護性蛋白，廣泛分布于大腦皮質、海馬、小腦、紋狀體、黑質及周圍神經系統等［17-18］。其特點是它的一級蛋白質結構具有4個EF臂能結合鈣離子，CB蛋白質分子在結合鈣離子前后，其構象由無活性狀態變為活性狀態，對鈣離子具有高親和性，進而參與一系列細胞內生理、生化過程。有研究表明，在特定腦區，衰老和AD患者中CB水平降低，對神經元內鈣的緩沖能力降低，導致AD中鈣介導的細胞毒性效應［19-20］。

CEGI注射液是由多種神經節苷脂、多肽、氨基酸、核酸組成的復方制劑，含有豐富的神經節苷脂（GM1、GD1a、GD1b、GT1b等）和天然生物活性多肽，具有神經修與再生、神經保護、營養與供能等作用，與神經細胞生長、發育、可塑性及學習記憶等高級神經功能密切相關，能促進受損中樞及周圍神經組織的功能恢復。CEGI已在臨床上用于AD的治療，但其機制尚不清楚，特別是利用國際公認的APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠模型研究CEGI的作用機制未見報道。

本實驗觀察到，APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠在每日給予Tg + CEGI-L、Tg + CEGI-H 1個月后，其空間學習和記憶能力均較Tg組明顯改善。在Tg + CEGI-L組，小鼠海馬CA1區的神經元標志性蛋白、具有緩沖細胞內鈣離子的CB表達顯著增加，說明CEGI注射液對APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠的大腦皮質神經元有保護和營養作用，其機制可能通過與NMDA受體相互作用，有效拮抗興奮性氨基酸對腦組織的毒性作用，如抑制細胞內鈣離子超載，從而減少Aβ42在大腦中的聚集沉積，并且通過過表達CB以調節細胞內鈣離子的濃度，減少細胞內鈣超載，降低鈣依賴性蛋白激酶的激活，減少氧自由基的生成，降低神經元損傷，進而改善AD認知功能。在Tg + Donepezil組，大腦皮質Aβ42老年斑的數目也顯著減少，Donepezil雖屬于膽堿酯酶抑制劑［21］，不直接降解Aβ42，但也可能通過拮抗NMDA受體，減少由其引起的細胞內鈣超載，進而減輕由NMDA誘發的神經元損傷，減少神經元的死亡，發揮其對神經元的保護作用。綜上，我們利用APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠AD小鼠模型，觀察了CEGI對AD的神經保護作用，然而深入機制還不十分清楚，CEGI對Aβ42抑制作用，對過表達CB的具體作用靶點和途徑還有待于進一步探討。

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Effect of cattle encephalon glycoside and ignotin injection on expression of amyloid β-peptide 42 and calbindin-D28k in APPswe /PS1dE9 transgenic mice

HU Yazhuo1， GAO Ya1， HAN Zhitao1， XIA Zheng1， GENG Yan1， LI Ruisheng2， CHEN Hongyan1， WANG Jianhua1， ZHANG Honghong1， WANG Luning1
1Institute of Geriatrics， Beijing Key Laborarory of Normal Aging and Geriatrics， Chinese PLA General Hospital， Beijing 100853，China；2Experimental Animal Center， Chinese PLA 302 Hospital， Beijing 100039， China
Corresponding author: ZHANG Honghong. Email: zhanghh301@sina.com； WANG Luning. Email: lnw_301@163.com

Objective To observe the effect of cattle encephalon glycoside and ignotin injection （CEGI） on expression of amyloid β-peptide （Aβ42） and calbindin-D28k （CB） in brain of APPswe /PS1dE9 double transgenic mice， and investigate its prevention and treatment for Alzheimer's disease. Methods A total of 48 male homozygous APPswe/PS1dE9 double transgenic mice were randomly divided into four groups， 12 in each group: low-dose CEGI group （Tg+CEGI-L； intraperitoneal injection of 6.6 ml/ （kg·d）CEGI）， high-dose CEGI group （Tg+CEGI-H； intraperitoneal injection of 13.2 ml/ （kg·d） CEGI）， positive control Donepezil group（Tg+Donepezil； intragastric administration of 2 mg/ （kg·d） Donepezil）， Tg group （intraperitoneal injection of equal volume of 0.9% saline）. Another 12 non-transgenic （nTg） wild-type littermates were served as normal control group （nTg， intraperitoneal injection of equal volume of 0.9% saline）. After one month of drug administration， Morris water maze test was used to assess the ability of learning and memory of the mice， and the changes of expression of Aβ42 in cortex were detected by Thioflavin-S and immunohistochemistry， respectively， and the changes of expression of CB in CA1 and CA3 hippocampal region were detected by immunohistochemistry. Results Compared with Tg group， the ability of learning and memory of mice in Tg+CEGI-L group improved significantly （P＜0. 05）. The expression of Aβ42 in the cortex in Tg+CEGI-L group and Tg+CEGI-H group was significantly lower than that of Tg group （43.00±10.03 vs 24.63±10.61， 24.89± 6.81， all P＜0.05）. The expression of CB in CA1 and CA3 hippocampal region was higher in Tg+CEGI-L group than in Tg group （0.056±0.023 vs 0.031±0.001， P＜0.05）. Conclusion CEGI can reduce the expression of Aβ42 in the cortex and increase the expression of CB in CA1 hippocampal regionin APPswe /PS1dE9 double transgenic mice and improve their ability of learning and memory.

cattle encephalon glycoside and ignotin injection； Alzheimer's disease； APPswe/PS1dE9 transgenic mice； amyloid β-peptide 42； calbindin-D28k

R 977.6

A

2095-5227（2015）07-0738-06

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.07.026

2015-03-17

胡亞卓，女，學士，主管技師。研究方向：老年退行性疾病分子病理研究。Email: huyazhuo301@aliyun.com；共同第一作者：高雅，女，碩士。研究方向：老年期癡呆。Email: elegance86@163.com

張紅紅，女，碩士，研究員，碩士生導師，副所長。Email: zhanghh301@sina.com；王魯寧，女，碩士，主任醫師，教授，博士生導師。Email: lnw_301@163.com