微激光照射肥大細胞對胞內鈣離子濃度的影響*

鐘會清，楊　輝，周　艷，郭周義*，黃漢傳，葉丙剛，倪藝榕，熊紅蓮，金 梅，吳秀麗，蘇成康，龍 佳，林 錦

（1.華南師范大學生物光子學研究院，國家中醫藥管理局中醫藥與光子技術三級實驗室，廣東廣州510631；2.無限極（中國）有限公司，廣東廣州510623）

微激光照射肥大細胞對胞內鈣離子濃度的影響*

鐘會清1，楊輝2，周艷2，郭周義1*，黃漢傳1，葉丙剛1，倪藝榕1，熊紅蓮1，金 梅1，吳秀麗1，蘇成康1，龍 佳2，林 錦2

（1.華南師范大學生物光子學研究院，國家中醫藥管理局中醫藥與光子技術三級實驗室，廣東廣州510631；2.無限極（中國）有限公司，廣東廣州510623）

目的：研究850 nm波長微激光對肥大細胞照射后胞內鈣離子濃度的影響。方法：實驗前12 h，將肥大細胞接種于激光共聚焦專用培養皿中，然后用D-Hank's液洗滌3次，加入2 mL D-Hank's液，按照照射時間不同共分六組（Control，1 min，2 min，2.5 min，3 min，4 min），其中，空白對照組不進行激光照射處理；激光照射后，棄去D-Hank's液，加入含有Fluo-3/AM的D-Hank's液1 mL，放入培養箱中孵育30 min后，用D-Hank's液洗滌3次去除胞外多余的Fluo-3/AM，再加入含有10%FBS的D-Hank's液2 mL，置激光掃描共聚焦顯微鏡檢測。結果：空白對照組中細胞內未見熒光，說明此時胞內無鈣離子，但從1 min開始在細胞中發現熒光，而且發現隨著照射時間的加長，其熒光強度越來越強，這可能與微激光照射時間越長從而刺激胞內出現更多的鈣離子有關。從上面的實驗說明850 nm微激光能作為仿灸儀器的光源。

生物光學；細胞內鈣離子濃度；微激光；肥大細胞；激光掃描共聚焦顯微鏡

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.004

0　引言

激光針灸是一種新的針灸療法，它通過采用激光照射人體穴位替代傳統毫針刺激穴位實現針灸治療的目的［1-3］。和傳統的毫針針灸相比，激光針灸具有非侵入性的特點，能降低因重復使用針具而發生交叉感染的風險。而且，激光針灸能緩解部分暈針患者（特別是兒童患者）對針具的恐懼心理。有研究表明激光針灸鎮痛具有良好的療效。Sven Gottschling等人采用830 nm激光器治療患有頭痛的兒童患者，激光輻照的穴位點選擇“合谷”、“足三里”、“三陰交”等。統計結果顯示激光針灸組的治療相對于對照組具有顯著效果［4］。但是由于激光器的成本過高及操作復雜阻礙了它的應用進一步推廣［5］。隨著現代科技的發展，新型的LED將以其在光強、波長、價格、壽命、外型尺寸等方面的優勢和與激光光源治療具有相似的療效成為醫療的新能源。例如前期王波等人已研究采用635 nm LED穴位照射對腎陽虛模型的影響，結果發現635 nm LED照射與艾灸療法對腎陽虛模型動物的治療具有相似的療效，說明635 nm LED可做為仿灸儀器［6，7］。

雖然針灸鎮痛效應及其作用機制已得到廣泛研究并取得了一定的進展，但是有關激光針灸鎮痛作用機制的研究相對較小，而且人們對其作用機制知之甚少。大量中醫研究表明機體穴位區肥大細胞參與鎮痛效應，而肥大細胞的脫顆粒線顯示產生此效應的一個重要環節。本實驗的目的主要研究850 nm微激光對肥大細胞內鈣離子的影響。

1　材料與方法

1.1激光掃描共聚焦顯微鏡

激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser scanning confocal microscopy，LSCM）是采用激光作為激發光源，激光束經顯微鏡光學部件后照射熒光標記的樣本上，激發出的熒光信號被光檢測器接收。該技術是在熒光顯微分析技術的基礎上發展起來的，利用熒光顯微鏡可以對生物樣品發出的熒光進行觀察和分析。采用通過針孔，擋住非焦平面的散射光，以減少焦平面上非測量點光信號干擾，通過掃描技術，可以獲取細胞內某個薄層面上的熒光信息，成像清晰程度得到大大提高。同時，通過顯微鏡自帶的部件和軟件，可以實現樣品的Z軸掃描和三維重構。當物鏡折射率一致時，采用激光掃描共聚焦顯微鏡可以使分辨率提高1.4倍，能夠在亞細胞水平上觀察諸如鈣離子、pH值、膜電位等生理信號及細胞形態的變化。激光掃描共聚焦顯微鏡廣泛應用于生物醫學的基礎研究中，其中最常見的應用是熒光定性和定量檢測［8，9］。例如，李瑞午等提出利用激光掃描共聚焦顯微鏡技術研究針灸經絡的思想，并觀察電針血清與正常血清對體外培養的大腦皮層細胞鈣離子的影響［10，11］。

1.2細胞質內的鈣離子

鈣信號在細胞的信號傳導和執行功能等各個方面都發揮著重要的作用，影響著從卵子受精到細胞調亡的整個生命過程。Ca2+既能充當第一信使啟動信號傳遞過程，也能充當第二信使，同時還調控細胞的生命過程，如遞質釋放、腺體分泌，肌肉收縮到細胞受精、發育、分化、凋亡等，都和鈣離子有關。靜息情況下，細胞外Ca2+濃度在mmol/L量級，而胞內Ca2+濃度（［Ca2+］）則為μmol/L水平，兩者相差1 000i～10 000倍［12，13］。

1.3胞內鈣離子的熒光測定法

Fluo-3是一種長波鈣熒光探針。因為激光掃描共聚焦顯微鏡具有氬激光器，所以Fluo-3被廣泛使用于這種顯微鏡上。這種熒光信號發出來的長波也有利于減小對樣品細胞的光損傷。Fluo-3/AM是Fluo-3的一種乙酰甲酯（Acetoxymethyl ester，AM）衍生物，脂溶性，很容易透過胞膜進入細胞，但不和鈣離子結合，沒有熒光，該探針是應用最廣泛的幾種檢測鈣離子濃度的探針之一。當FLuo-3/AM被細胞內的酯酶催化失去AM后，產生的Fluo-3變成水溶性而不能透過胞膜流出細胞外。Fluo-3若以游離配體形式存在時幾乎是非熒光性的，但是當它與鈣離子結合后熒光會增加60～80倍。

1.4主要試劑與儀器參數

細胞培養板、培養瓶、共聚焦培養皿（Cornning公司）。Fluo-3/AM（鈣離子熒光探針，Biotium）；DHank's液:自行配置；胎牛血清（FBS，Gibco公司）。

激光掃描共聚焦顯微鏡LSM710（廣東省農業科學院農業生物基因研究中心，如圖1）:德國ZEISS公司，參數設置如下:60倍油鏡，激發光波長為488 nm，探測器波長范圍為490 nm～600 nm。

1.5微激光處理

采用中心波長在850 nm的近紅外LED（FWHM =30 nm）（圖2），24個LED燈珠以6×4排列方式組合成一個LED陣列，其大小主要根據96孔板的大小來定。

圖1　激光掃描共聚焦顯微鏡（LSM710）Fig.1　Laser scanning confocalmicroscopy（LSM710）

圖2　850 nm LED的光譜Fig.2　The spectrum of LED with a central wavelength of 850 nm

1.6實驗方法

選用RBL-2H3細胞為細胞模型。實驗前12 h，將RBL-2H3細胞接種于激光共聚焦專用培養皿中；開始實驗前，配置好10 μmol/L的Fluo-3/AM溶液（50 μg溶于22 μL DMSO，再用D-Hank's液稀釋到4.4 mL），然后放入在37℃培養箱中孵育30 min備用；將已接種于激光共聚焦專用培養皿中的細胞用D-Hank's液洗滌3次，加入2 mL D-Hank's液，分六組，每組按照表1的處理方法進行照射，其中，空白對照組不進行微激光照射處理；微激光照射后，棄去D-Hank's液，加入含有Fluo-3/AM的D-Hank's液1 mL，放入培養箱（37℃，5%CO2）中孵育30 min后，棄去含Fluo-3/AM的D-Hank's液，用D-Hank's液洗滌3次以去除胞外多余的Fluo-3/AM，再加入含有10%FBS的D-Hank's液2 mL，置激光掃描共聚焦顯微鏡檢測。

2　結果和分析討論

表1　850 nm的微激光照射肥大細胞時所對應的功率密度和能量密度Tab.1　The power density and energy density of 850 nm micro-laser irradiated mast cells

圖3　肥大細胞經中心波長為850 nm微激光分別照射0 min和1 min后鈣離子顯微成像（左邊圖為白光圖，中間圖為純熒光圖，右邊圖為白光圖和熒光圖合并圖）Fig.3　The confocal microscope images of［Ca2+］i in mast cells by 850 nm micro-laser irradiated 0 min and 1 min（white light image（left），fluorescence image（middle），white light and fluorescence（right））

圖4　肥大細胞經中心波長為850 nm微激光分別照射2 min和2.5 min后鈣離子顯微成像（左邊為白光圖，中間為純熒光圖，右邊為白光圖和熒光圖合并圖）Fig.4　The confocal microscope images of［Ca2+］i in mast cells by 850 nm micro-laser irradiated 2 min and 2.5 min（white light image（left），fluorescence image（middle），white light and fluorescence（right））

圖5 肥大細胞經中心波長為850 nm微激光分別照射3 min和4 min后鈣離子顯微成像（左邊為白光圖，中間為純熒光圖，右邊為白光圖和熒光圖合并圖）Fig.5　The confocal microscope images of［Ca2+］i in mast cells by 850 nm micro-laser irradiated 3 min and 4 min（white light image（left），fluorescence image（middle），white light and fluorescence（right））

圖3為肥大細胞經中心波長850 nm微激光照射0 min和1 min后的熒光圖，從圖上發現在微激光照射0 min（空白對照組，即微激光光源處于關閉狀態）未見熒光，但是相同參數下測得經850 nm微激光的光照射肥大細胞1 min熒光圖片上可見微弱的熒光，說明肥大細胞經中心波長850 nm微激光刺激1 min能使其鈣離子濃度升高。

圖4和圖5分別是在相同激光掃描共聚焦顯微成像的參數下測得經850 nm微激光的光照射肥大細胞2 min、2.5 min、3 min、4 min。從圖上可見隨著照射時間的加長，胞內鈣離子的熒光強度也隨著增加，這可能是因為光灸效應作用分子能夠引起活細胞的細胞質中的鈣離子增加。前期黃義梅等人研究得出光灸效應作用分子引起鈣離子濃度升高的途徑可能為兩種:第一種是細胞外鈣離子內流，另一種是細胞內鈣庫釋放鈣離子到細胞質中。細胞內鈣庫釋放鈣離子可能是光灸效應作用分子引起細胞質中鈣離子升高的主要原因［14，15］，本實驗結果與黃義梅研究結果一致。另外還發現在照射后2 min、2.5 min和3 min細胞形態較完整。但是經850 nm微激光照射肥大細胞4 min后，有小部分肥大細胞破碎喪失細胞完整性，說明該劑量的微激光輻射對細胞會造成損傷。

本實驗中，使用微激光850 nm波長的光照射肥大細胞的結果表明，850 nm的光能夠有效刺激肥大細胞胞內鈣庫釋放鈣離子至細胞質中以引發進一步細胞反應，例如肥大細胞脫顆粒釋放組胺。同時因為大量中醫研究表明機體穴位區肥大細胞參與鎮痛效應，而肥大細胞的脫顆粒線顯示產生此效應的一個重要環節。肥大細胞脫顆粒產生組胺、P物質可通過以下兩種方式共同作用到靶器官:①通過組織液定向流動傳遞到沿經脈線上的其他肥大細胞處誘使其進一步脫顆粒；②活性物質刺激神經末梢引起軸索反射，再次釋放P物質，誘發肥大細胞脫顆粒，顆粒物質進一步刺激相鄰神經末梢，如此往復，光灸神經興奮信號在不同階段被整合和修飾后產生鎮痛和其他靶器官調整效應。

［1］ 黃義梅.針灸效應細胞響應的光學檢測［D］；福建師范大學，2013. HUANG Yimei.Study of cellular response to acupuncture effects by optical techniques［D］.Fujian Normal University，2013.

［2］YURTKURAN M，KONUR S，OEZCAKIR S，et al.Laser acupuncture in knee osteoarthritis:A double-blind，randomized controlled study［J］.Photomedicine and Laser Surgery，2007，25（1）:14-20.

［3］BAXTER G DAVID，BLEAKLEY CHRIS，MCDONOUGH SUZANNE.Clinical effectiveness of laser acupuncture:a systematic review［J］.Journal of Acupuncture and Meridian Studies，2008，1（2）:65-82.

［4］GOTTSCHLING SVEN，MEYER SASCHA，GRIBOVA INESSA，et al.Laser acupuncture in children with headache:A double-blind，randomized，bicenter，placebo-controlled trial［J］. Pain，2008，137（2）:405-412.

［5］LIN M L，WU H C，HSIEH Y H，et al.Evaluation of the effect of laser acupuncture and cupping with ryodoraku and visual analog scale on low back pain［J］.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2012:1-7.

［6］王波，楊華元，劉堂義，等.635nm LED穴位照射對腎陽虛模型大鼠的光生物調節作用［J］.中國激光醫學雜志，2010，（03）:142-147，202. WANG Bo，YANG Huayuan，LIU Tangyi，et al.Photobiomodulation of 635nm LED point irradiation on Kidney-Yang deficiency model rats［J］.Chinese Journal of Laser Medicine and Surgery，2010，（03）:142-147，202.

［7］程珂，沈雪勇，丁光宏，等.激光針灸鎮痛效應與穴區肥大細胞功能的關系［J］.中國針灸，2009，29（06）:478-483. CHENG Ke，SHEN Xueyong，DING Guanghong，et al.Relationship between laser acupuncture a nalgesia and function of cells［J］.Chinese Acupucture&Moxibustion，2009，29（6）: 478-483.

［8］王海燕，何韶衡，林玨龍.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察胰蛋白酶對肺上皮細胞游離鈣離子的影響［J］.激光生物學報，2005，14（05）:61-63. WANG Haiyan，HE Shaoheng，LIN Juelong.Effect of free calcium in H292 cells through protease activated receptor-2［J］. ACTA Laser Biology Sinica，2005，14（05）:61-63.

［9］叢玉隆，王俊玫，李楠，等.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察血小板內鈣離子濃度的變化［J］.中華醫學雜志，1997，77（09）:687-691. CONG Yulong，WANG Junmei，LI Nan，et al.Platelet calcium oscillation by laser scanning confocal microscopy［J］.Natl Med J China，1997，77（09）:687-691.

［10］ 李瑞午，景向紅，蔡虹.激光共焦掃描顯微鏡在針灸經絡研究中的應用（推薦一種現代科學研究手段）［J］.針刺研究，1995，20（02）:76-78. LI Ruiwu，JING Xianghong，CAI Hong.Confocal laser scan microscope system and its applications on studying acupuncture and meridian［J］.Acupuncture Research，1995，20（02）:76-78.

［11］李瑞午，張金鈴，郭瑩，等.針灸血清對大腦皮層細胞內鈣離子的影響初探--針灸體液機理的研究［J］.中國針灸，2005，25（05）:351-354. LI Ruiwu，ZHANG Jinling，GUO Ying，et al.Preliminary study on effect of acupuncture serum on Ca2+content in cultured neurons of cerebral cortex［J］.Chinese Acupucture& Moxibustion，2005，25（05）:351-354.

［12］郭祎，任兆玉，侯洵.細胞內第二信使-鈣離子熒光測定方法的研究進展［J］.激光雜志，2003，24（01）:1-5 GOU Yi，REN Zhaoyu，HOU Xun.Fluorescence methods for analyzing intracellular seecond messenger-calcium Ion［J］.Laser Journal，2003，24（01）:1-5.

［13］汪月霞，王忠，顧蘊潔，等.鈣離子在向光性和向重性反應信號轉導中的作用［J］.安徽農業科學，2007，35（10）: 2877-2878. WANG Yuexia，WANG Zhong，GU Yunjie，et al.Effect of Ca2+in signal transduction with phototropism and gravitropism reaction［J］.Journal of Anhui Agri Sci，2007，35（10）:2877-2878.

［14］黃義梅，楊洪欽，謝樹森.基于光學成像技術的針灸鎮痛機理研究［J］.激光與光電子學進展，2011，48（11）:74-79. HUANG Yimei，YANG Hongqin，XIE Shusen.Study of acupuncture analgesic mechanism based on optical imaging technology［J］.Laser&Optoelectronics Progress，2011，48（11）: 74-79.

［15］HUANG Y，ZHENG L，YANG H，et al.Calcium mobilization in HeLa cells induced by nitric oxide［J］.Scanning，2013，36（02）:258-262.

The Effect of Micro-laser on Intracellular Free Calcium Concentration of Mast Cell

ZHONG Huiqing1，YANG Hui2，ZHOU Yan2，GUO Zhouyi1*，HUANG hanchuan1，YE Bingang1，NI Yirong1，XIONG Honglian1，JIN Mei1，WU Xiuli1，SU Chengkang1，LONG Jia2，LIN Jin2
（1.SATCM Third Grade Laboratory of Chinese Medicine and Photonics Technology，College of Biophotonics，South China Normal University，Guangzhou 510631，Guangdong，China；2.Infinitus（China）Company Ltd，Guangzhou 510623，Guangdong，China）

Objective:To investigate the effects of micro-laser irradiation on intracellular calcium concentration（［Ca2+］i）of mast cell.Methods:12 hours before the experiment，The mast cells were seeded into paltes，which wereused on the laser scanning confocal microscopy（LSCM）.Then the cells were washed three times with D-hank's solution，and added 2 mL D-hank's solution to each group.There were six groups，which were irradiated at different times（Control，1 min，2 min，2.5 min，3 min，4 min）by micro-laser 850 nm.The control group was irradiated 0 min.After micro-laser irradiation，the cells were removed the D-hank's solution，and loaded with 1 mL Fluo-3/AM at 37°C for 30 min.The cells were washed again for another three times with D-hank's solution to remove the unloaded Fluo-3/AM in the medium，and then added 2 mL D-hank's solution with 10%FBS.The images of Ca2+concentration in each group cells were monitored by LCSM.Result:The results have shown that there were no fluorescence in the control group.It clearly indicated that there were no Ca2+in the control group cells.But in the irradiated 1 min group，there was significant fluorescence.Following the time of irradiation increasing，the fluorescence intensity were enhanced.The intracellular calcium concentration become higher，which may be related to the micro-laser irradiation time increase.It has shown that the 850 nm micro-laser could be the optical source of moxibustion instrument.

biological optics；intracellular calcium concentration（［Ca2+］i）；micro-laser；mast cell；laser scanning confocal microscopy（LSCM）

Q682

A

1007-7146（2015）04-0326-05

2015-05-24；

2015-06-02

無限極（中國）有限公司委托重大技術開發項目（HPG/2013/11/1598）；國家自然科學基金項目（No. 61335011，No61275187；No.31300691&No.11404116）；教育部高等學校博士學科點專項科研基金項目（No.20114407110001&No.20134407120003）；廣東省自然科學基金重點項目（No.2014A030311024）；廣東省重大科技專項項目（No.2012A080203008）；廣東省教育廳科技創新項目（No.2013KJCX0052）

鐘會清（1979-），女，湖南衡陽，講師。研究方向:生物醫學光子學、光譜檢測與成像、光學診斷。（電子郵箱）zhonghq@scnu.edu.cn

郭周義（1965-），男，浙江諸暨人，教授，博士生導師。（電子郵箱）ann@scnu.edu.cn