NTERA-2的精原干細(xì)胞生物學(xué)特征鑒定*

王姿力，周勇華，羅 超，莫艷秀，2，肖亞梅*

（1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教育部蛋白質(zhì)化學(xué)和魚類發(fā)育生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410081；2.湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，湖南郴州423000）

NTERA-2的精原干細(xì)胞生物學(xué)特征鑒定*

王姿力1，周勇華1，羅 超1，莫艷秀1，2，肖亞梅1*

（1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教育部蛋白質(zhì)化學(xué)和魚類發(fā)育生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410081；2.湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，湖南郴州423000）

本研究通過免疫熒光分析，鑒定NTERA-2細(xì)胞是否具有精原干細(xì)胞特征。研究結(jié)果顯示，重要精原干細(xì)胞標(biāo)記分子GFRα-1和DDX4在NTERA-2細(xì)胞中均表現(xiàn)為陽性表達(dá)，NTERA-2細(xì)胞具有精原干細(xì)胞的特征。初步探討了重要細(xì)胞信號轉(zhuǎn)換蛋白JNK特異性抑制劑SP600125對NTERA-2細(xì)胞生長和增殖的影響，為進(jìn)一步以NTERA-2細(xì)胞為精原干細(xì)胞模型開展JNK對生殖細(xì)胞發(fā)育調(diào)節(jié)功能的研究奠定基礎(chǔ)。

NTERA-2；精原干細(xì)胞；SP600125；免疫熒光技術(shù)

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.011

睪丸腫瘤是泌尿外科中常見的腫瘤之一，惡性比例高達(dá)95%，包括生殖細(xì)胞腫瘤、非生殖細(xì)胞腫瘤和睪丸繼發(fā)性腫瘤［1］。睪丸生殖細(xì)胞腫瘤（Testicular germ cell tumors，TGCT）約占睪丸腫瘤病例的90%～95%，是睪丸腫瘤中最多見的類型，涉及到幾類不同發(fā)病機(jī)制、病理類型和臨床表現(xiàn)，一般又可分為精原細(xì)胞瘤、非精原細(xì)胞瘤（包括胚胎癌、畸胎瘤、絨毛膜上皮癌等）及混合性生殖細(xì)胞瘤［2，3］。Skakkebaek等提出生殖細(xì)胞腫瘤是發(fā)展于曲精細(xì)管內(nèi)的生殖細(xì)胞腫瘤，即睪丸原位癌（Carcinoma in situ，CIS）［4，5］。

NTERA-2（NT2）細(xì)胞（Testicular embryonal carcinoma cells）是來源于人睪丸畸胎瘤細(xì)胞［6，7］。目前NTERA-2細(xì)胞在癌細(xì)胞增殖周期分子調(diào)控機(jī)制、腫瘤細(xì)胞凋亡、腫瘤的藥物治療等方面有不少研究報(bào)道［8］。同時(shí)NTERA-2在細(xì)胞擴(kuò)增和分化方面具有與胚胎干細(xì)胞部分相似的分子和細(xì)胞生物學(xué)特征，維持著胚胎干細(xì)胞發(fā)育的多能性［9］，研究認(rèn)為NTERA-2細(xì)胞可為細(xì)胞命運(yùn)定型以及胚胎干細(xì)胞分化過程中的調(diào)控機(jī)制研究提供細(xì)胞研究模型［10，11］。

本研究通過對生殖干細(xì)胞表面標(biāo)志分子的鑒定，確定NTERA-2細(xì)胞是否具有生殖干細(xì)胞生物學(xué)特性，初步探討了重要細(xì)胞信號轉(zhuǎn)換蛋白JNK特異性抑制劑SP600125對NTERA-2細(xì)胞生長和增殖的影響，為進(jìn)一步以NTERA-2細(xì)胞為精原干細(xì)胞模型開展JNK對生殖細(xì)胞發(fā)育調(diào)節(jié)功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1　實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1材料

NT2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。Hoechst 33342購于美國Sigma公司，c-kit，DDX4，GFRα-1抗體均購于Santa Cruz Biotechnology公司，JNK抑制劑SP600125購于碧云天公司，二抗是帶熒光標(biāo)記的羊抗鼠GAM和羊抗兔GAR均購于康為世紀(jì)公司，MEM培養(yǎng)基，胎牛血清FBS，雙抗青霉素和鏈霉素均購于Life Technologies公司，其他常規(guī)試劑均購自上海生工生物工程有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

NTERA-2細(xì)胞用Eagle's Minimum Essential Medium（MEM）培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中包含10%的胎牛血清（FBS，Life Technologies，Inc.，Grand Island，NY，USA）、1%的抗生素（100 U/mL青霉素和100 ng/mL鏈霉素；Life Technologies）。在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時(shí)，NTERA-2細(xì)胞均經(jīng)0.25%胰酶（Trypsin-EDTA）溶液消化2-3 min。

1.3細(xì)胞免疫熒光染色

細(xì)胞接種于四孔板中，接種細(xì)胞量約2.5×105cell/孔。待四孔板中的細(xì)胞貼壁且生長狀態(tài)良好后，移去完全培養(yǎng)基，PBS清洗后加入4%多聚甲醛。室溫固定30 min，PBS漂洗三次，每次5 min。用現(xiàn)配好的封閉液（含0.1%Triton和2%BSA的PBS緩沖液）封閉處理20 min。滴加一抗（1∶100稀釋），4℃孵育過夜。PBS漂洗三次后，加二抗（1∶100稀釋），避光室溫孵育1 h。PBS漂洗后，加入Hoechst 33342染色液室溫避光染15 min，PBS漂洗兩次。熒光顯微鏡下觀察。

1.4SP600125抑制處理

將生長處于對數(shù)期的NTERA-2細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞接種量約為1.2×106cell/孔。培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的SP600125抑制劑（0，25，50 μmol/L）分別處理24 h，48 h和72 h，置于相差顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)。

2　結(jié)果

圖1　幾種重要干細(xì)胞因子在NT2細(xì)胞的表達(dá)鑒定Fig.1　The expression of several important stem cell factor in NT2 cells

2.1幾種重要干細(xì)胞因子在NTERA-2細(xì)胞中的鑒定通過免疫組織化學(xué)方法，分析了胚胎干細(xì)胞標(biāo)記分子c-kit和哺乳動物兩種重要精原干細(xì)胞標(biāo)記分子GFRα-1和DDX4在NTERA-2細(xì)胞中的表達(dá)。如圖1所示，c-kit、GFRα-1和DDX4在NTERA-2細(xì)胞中均呈現(xiàn)出明顯的陽性表達(dá)。

2.2SP600125抑制劑處理對NTERA-2細(xì)胞生長和增殖的影響

用JNK特異性抑制劑SP600125對NTERA-2進(jìn)行藥物孵育實(shí)驗(yàn)，觀察顯示SP600125對NTERA-2的生長具有明顯的抑制作用，并導(dǎo)致NTERA-2細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡現(xiàn)象（圖2）。NTERA-2細(xì)胞的凋亡程度與SP600125藥物濃度和處理時(shí)間呈正相關(guān)。

圖2　SP600125藥物孵育對NT2細(xì)胞生長的影響Fig.2　The effect of SP600125 on the NT2 cells

3　討論

c-kit基因編碼一種胚胎時(shí)期干細(xì)胞生長因子的受體，是生殖細(xì)胞和造血干細(xì)胞增殖、分化、移行及存活所必需的［12］。DDX4（DEAD box polypeptide 4）基因是DEAD-box基因家族的重要成員，僅在生殖細(xì)胞系中特異性表達(dá)，在哺乳動物睪丸組織中，DDX4基因從精子發(fā)生減數(shù)分裂前開始表達(dá)一直持續(xù)到減數(shù)分裂后生精細(xì)胞的形成［13］。目前DDX4基因廣泛用于配子發(fā)生和原生殖細(xì)胞的起源、遷移、分化等的研究中。GFRα-1是GDNF（膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子）的受體，是嚙齒類動物精原干細(xì)胞（SSCs）特異的細(xì)胞表面分子標(biāo)志物［14］。研究結(jié)果顯示，在NTERA-2細(xì)胞中不僅有c-kit基因的表達(dá)，而且也檢測到DDX4和GFRα-1這些精原干細(xì)胞特異標(biāo)記分子的表達(dá)，表征著NTERA-2細(xì)胞具有精原干細(xì)胞特征。

JNK（c-Jun氨基末端激酶）是促分裂原活化蛋白激酶超家族中的主要成員之一。生長因子、細(xì)胞因子、應(yīng)激等多種細(xì)胞外刺激通過激活JNK信號通路，在動物的生長發(fā)育、細(xì)胞凋亡、癌癥的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用［15，16］。最新的研究報(bào)道了JNK參與維系干細(xì)胞發(fā)育潛能，在誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞建立上具有重要調(diào)控作用［17］。本實(shí)驗(yàn)室也已證實(shí)JNK參與動物生殖腺早期分化和發(fā)育調(diào)控［18］。SP600125是一種常用的c-Jun N-terminal kinase（JNK）的高選擇性抑制劑，SP600125處理斑馬魚胚胎或魚苗，能顯著影響斑馬魚性腺的分化發(fā)育，證實(shí)JNK在魚類性腺早期分化發(fā)育中重要調(diào)節(jié)功能［19］。但JNK通路在生殖細(xì)胞發(fā)育調(diào)控中的分子機(jī)制尚不明晰。本文初次以NTERA-2作為生殖干細(xì)胞模型，用JNK抑制劑SP600125處理NTERA-2細(xì)胞，研究表明，SP600125能顯著抑制NTERA-2細(xì)胞的生長和增殖，為進(jìn)一步深入探討JNK在精原干細(xì)胞增殖與凋亡中的功能奠定了基礎(chǔ)。

［1］ ULBRIGHT T M.Germ cell neoplasms of the testis［J］.The A-merican Journal of Surgical Pathology，1993，17（11），1075-1091.

［2］PIETENPOL J A，BOHLANDER S K，SATO Y，et al.Assignment of the human P27 gene to 12p and its analysis in leukemias［J］.Cancer Res，1995，55（6）:1206-1210.

［3］HORWICH A，SHIPLEY J，HUDDART R.Testicular germ-cell cancer［J］.Lancet，2006，367（9512）:754-765.

［4］SKAKKEBAEK N E.Possible carcinoma-in-situ of the testis［J］.Lancet，1972，300（7776）:516-517.

［5］ALMSTRUP K，HOEI HANSEN C E，NIELSEN J E，et al.Genome-wide gene expression profiling of testicular carcinoma in situ progression into overt tumours［J］.Br J Cancer，2005，92（10）:1934-1941.

［6］LOOIJENGA L，OOSTERHUIS J W.Pathogenesis of testicular germ celltumours［J］.Reviews of Reproduction，1999，4（2）: 90-100.

［7］LOOIJENGA L，OOSTERHUIS J W.Pathogenesis of testicular germ celltumours［J］.Reviews of Reproduction，1999，4（2）: 90-100.

［8］易朵，李曉峰，周暢，等.阿司匹林誘導(dǎo)人惡性睪丸生殖細(xì)胞瘤NTera-2細(xì)胞凋亡［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2012，28（7）:630-636. YI Duo，LI Xiaofeng ZHOU Chang，et al.Curcumin inhibits AP-2γ to induce apoptosis in human malignant testicular germ cell line NTera-2［J］.Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2012，28（7）:630-636.

［9］LOOIJENGA L，OOSTERHUIS J W.Pathogenesis of testicular germ celltumours［J］.Reviews of Reproduction，1999，4（2）: 90-100.

［10］ RAJARSHI PAL，GEETA RAVINDRAN.Assessment of pluripotency and multilineage differentiation potential of NTERA-2 cells as a model for studying human embryonic stem cells［J］. Cell Prolif，2006，39（6）:585-598.

［11］PRZYBORSKI S A，CHRISTIE V B，et al.Human embryonal carcinoma stem cells:models of embryonic development in humans［J］.Stem Cells Dev，2004，13（4）:400-408.

［12］RONNSTRAND L.Signal transduction via the stem cell factor receptor/c-Kit［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2004，61（19-20）:2535-2548.

［13］HICKFORD D E，F(xiàn)RANKENBERG S，DASK A J.et al. DDX4（VASA）is conserved in germ cell development in marsupials and monotremes［J］.Biology of Reproduction，2011，85（4）:733-743.

［14］TADOKORO Y，YOMOGIDA K，OHTA H，et al.Homeostatic regulation of germinal stem cell proliferation by the GDNF/FSH pathway［J］.Mechanisms of Development，2002，113（1）: 29-39.

［15］VAN HORN R D，CHU S，F(xiàn)AN L，et al.Cdk1 activity is required for mitotic activation of aurora A during G2/M transition of human cells［J］.2010，285（28）:21849-21857.

［16］WESTON C R，DAVIS R J.The JNK signal transduction pathway［J］.Curr Opin Cell Biol，2007，19（2）:142-149.

［17］SCHWARTZ C M，SPIVAK C E，BAKER S C et al.NTera2: a model system to study dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells［J］.Stem Cells Dev，2005，14（5）: 517-534.

［18］KATNER A L，GOOTMA P，HOANG Q B，et al.A recombinant adenoviurs expressing P7（kiP1）induces cell cycle arrest and apoptosis in human 786-0 renal carcinoma cell［J］.J Urol，2002，168（2）:766-773.

［19］YAMEI XIAO，YONG HUA，XIONG ZHEN，et al.Involvement of JNK in the embryonic development and organogenesis in Zebrafish［J］.Mar Biotechnol（NY），2013，15（6）: 716-725.

NTERA-2 cells with Characteristics of Spermatogonial Stem Cells

WANG Zili1，ZHOU Yonghua1，LUO Chao1，MO Yanxiu1，2，XIAO Yamei1*
（1.Key Lab of Protein Chemistry and Developmental Biology of Education Ministry of China，College of Life Sciences，Hunan Normal University，Changsha 410081，Hunan，China；2.Department of Bascal Medicine，Xiang Nan University，Chenzhou 423000，Hunan，China）

This study was to identify the characteristics of NTERA-2 cells to find whether out has it the characteristics of spermatogonial biology.Our results showed that NTERA-2 cells expressed some markers of spermatogonial stem cells，such as GFRα-1 and DDX4.It suggest that NTERA-2 cells maybe useful as a model for studying spermatogonial stem cell proliferation and differentiation in vitro.With the treatment by SP600125，the proliferation of NTERA-2 cells is seriously inhibited.The results are the foundation of further research on the function of JNK in germ cell development.

NTERA-2；spermatogonial stem cell；SP600125；immunofluorescence

Q492

A

1007-7146（2015）04-0364-04

2014-12-15；

2015-04-14

國家自然科學(xué)基金（31172399）資助項(xiàng)目；湖南省教育廳項(xiàng)目資助（15C1274）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目資助（CX2013B212）

王姿力（1989-），女，漢族，湖南津市人，碩士研究生，主要從事動物發(fā)育中的信號傳導(dǎo)機(jī)制研究。（電話）15874113790；（電子郵件）camilla.wzl@foxmail.com

肖亞梅（1968-），女，湖南宜章人，湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授，主要從事動物發(fā)育和人類疾病中的信號傳導(dǎo)機(jī)制研究。（電話）0731-88872297；（電子郵箱）yameix@126.com