丹參愈傷組織培養中激素濃度的優化研究*

荊瑞勇，王麗艷，郭永霞

（黑龍江八一農墾大學，黑龍江大慶163319）

丹參愈傷組織培養中激素濃度的優化研究*

荊瑞勇，王麗艷，郭永霞*

（黑龍江八一農墾大學，黑龍江大慶163319）

目的：優化丹參愈傷組織繼代培養中激素濃度的最佳組合。方法：以丹參種子為外植體，以無菌苗下胚軸誘導的初代愈傷組織為材料，以愈傷組織凈增鮮重為指標，利用二次正交旋轉組合設計方法進行數學模擬，建立數學模型，利用響應面法進行激素濃度組合尋優。結果：丹參愈傷組織繼代培養中激素濃度的最佳組合為6-BA 1.514 mg/L+NAA 2.059 mg/L+2，4-D 2.137 mg/L；愈傷組織的凈增殖鮮重為35.66 g。

丹參；響應面法；愈傷組織；激素濃度

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.014

丹參（Saliae Miltiorrhiza Bge）為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物。其有效成分為丹參酮、隱丹參酮、丹參新酮、原兒茶醛、鼠尾草酚等。中藥中以其根及根莖入藥，具有去瘀生新、活血調經、消腫止痛、鎮靜安神等功效，因此臨床上用于治療產后瘀阻腹痛、月經不調、痛經、神經衰弱失眠等癥狀。另外丹參在人類心腦血管疾病、抗衰老、抗癌等方面具有良好的治療效果［1，2］。隨著丹參制劑在國內外心血管藥物市場上的占有量不斷提高對丹參的需求量迅速擴大。

中草藥藥用成分可以通過三種方式獲得:一是可用植株提取；二是經愈傷組織細胞懸浮培養方式獲得；三是經毛狀根培養獲得。三種方式各有優缺點，第一種方式是受自然資源的限制；后兩種方式是難于找到最佳的培養條件。本文以丹參下胚軸為外植體進行愈傷組織誘導，對愈傷組織增殖的培養基利用響應面法進行優化，并對懸浮培養做了初步研究，為懸浮細胞的培養和丹參愈傷組織的擴大化培養提供理論依據和技術支持。

1　材料與方法

1.1試驗材料

丹參種子，購于河北省安國市藥材市場。

1.2試驗方法

1.2.1丹參種子的消毒方法 首先將丹參種子用清水沖干凈，然后在超凈工作臺中先用75%乙醇浸泡種子2 min，將乙醇倒出后再用0.1%升汞溶液浸泡種子15 min后倒出，最后用無菌蒸餾水沖洗5次后，備用。

1.2.2丹參初代愈傷組織的獲得 將消毒好備用的丹參種子接種于MS基本培養基中進行發芽暗培養。待苗長到3-5 cm高時，將其下胚軸切割成約0.5 cm長的小段放入培養基MS+1.0 mg/L 6-BA+ 1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D中進行初代愈傷組織的誘導培養。

1.2.3培養基及試驗設計 基本培養基選用MS；選擇組織培養中最常用的三種激素6-BA（6-芐氨基嘌呤），2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），NAA（萘乙酸）為試驗因素。各因素變化區間由預試驗確定，查表確定星號臂即γ值，結果見表1。用二次正交旋轉組合設計安排試驗見表2。

1.2.4丹參愈傷組織最佳培養基的篩選 將培養15 d的初代愈傷組織切成大小平均為0.25 g的小塊接入表2的培養基中進行繼代培養，每個處理接種5瓶，每瓶4塊，每個處理總計20塊，總質量為5 g，即初始鮮重為5 g。接種15 d以后，將愈傷組織取出去除干凈培養基后進行鮮重的稱量即為最終鮮重，以凈增鮮重（即最終鮮重-初始鮮重）為指標進行最佳培養基的篩選。

1.2.5數據分析 二次正交旋轉組合設計試驗的數據按照二次回歸方程的預測模型進行回歸分析。分析軟件使用SAS（Statistical Analysis System）9.1，自編程序。

表1　試驗因素水平編碼表Tab.1　Coded levels of variables of the orthogonal rotary composite experimental design

2　結果與分析

2.1回歸模型的建立與檢驗

根據表2中的數據，利用SAS RSREG Procedure對試驗數據進行分析，得到回歸模型如下:y=-45.

對模型（式1）進行方差分析，結果（表3）表明:此模型的決定系數R2為0.9548，回歸模型達到高度顯著水平（P＜0.0001），說明此模型能夠95.48%的模擬實際情況。逐項顯著性檢驗結果表明，線性項和二次項對試驗結果均有極顯著性影響，其決定系數分別為0.3676和0.5849。而互作項對試驗結果無顯著性影響，其決定系數僅為0.0023。對模型失擬進行顯著性檢測，結果P=0.2079＞0.05，不顯著，說明該二次模型能夠擬合真實的試驗結果［5］。

對回歸模型各系數的顯著性分析，結果（表4）表明:各互作項的系數顯著性大于0.05，其余各項均小于0.05，因此優化后得到的模型為:y=-45.176

2.2培養基激素濃度組合尋優

利用RSREG Procedure進行典型分析，得到一個穩定點見表5:6-BA（x1）為1.169 mg/L、NAA（x2）為1.118 mg/L、2，4-D（x3）為1.130 mg/L，并判斷該點為最大值點，其愈傷組織凈增鮮重（y）為35. 66 g。

以MS+6-BA 1.169 mg/L+NAA 1.118 mg/L +2，4-D 1.130 mg/L為培養基，接種愈傷組織，接種5瓶，每瓶4塊，總計20塊，總質量為5 g，重復試驗3次，培養15 d后稱取愈傷組織凈增鮮重分別為34.45 g、34.05 g、36.85 g平均為35.12 g，略低于預測值，但差值小于5%。因此可將6-BA（x1）為1.169 mg/L、NAA（x2）為1.118 mg/L、2，4-D（x3）為1.130 mg/L作為增殖培養基激素的最佳濃度組合。應用丹參愈傷組織繼代培養的最佳培養基MS +6-BA 1.169 mg/L+NAA 1.118 mg/L+2，4-D 1.130 mg/L，培養出的愈傷組織較疏松，為黃綠色（圖1）。

表2　正交旋轉組合試驗設計方案及結果Tab.2　Quadratic orthogonal rotary composite experimental design and experimental result

表3　二次響應面回歸模型方差分析Tab.3　Analysis of variance（ANOVA）of the regression model of quadratic response

表4　回歸模型系數的顯著性分析Tab.4　Analysis of variance for regression model

表5　典形分析（穩定點、特征值和特征向量表）Tab.5　Canonical analysis of response surface based on coded data（stationary point，eigenvalues and eigenvectors）

圖1　最佳培養基誘導出的愈傷組織Fig.1　Callus induced under optimized culture condition

2.4丹參細胞懸浮培養

將在篩選出的最佳培養基上生長的愈傷組織接種到不加瓊脂的液體培養基:MS+6-BA 1.169 mg/L +NAA 1.118 mg/L+2，4-D1.130 mg/L中進行液體懸浮培養，結果發現:在此培養基中懸浮細胞生長良好，培養周期為15 d，懸浮細胞團為淡黃褐色，最大的細胞團如黃豆粒般大小（圖2）。

3　小結與討論

通過數學模擬得到的模型為:y=-45.176+17. 705·x1+79.102·x2+46.496·x3-7.578·x12-34.185· x22-20.785·x32。通過模擬尋優得到的丹參愈傷組織繼代培養的最佳培養基為:MS+6-BA 1.169 mg/L+ NAA 1.118 mg/L+2，4-D 1.130 mg/L，其愈傷組織凈增鮮重y為35.66 g。

影響植物組織培養成功的因素有很多，其中最主要的是激素的種類和濃度。在植物組織培養激素優化的過程中可利用多種試驗設計，其中采用完全隨機試驗設計的比較多，在旱半夏繼代增殖培養基的篩選過程中就利用了完全隨機試驗設計方法［3］；在薺菜芽分化增殖最適培養基的篩選中也利用了此設計方法［4］。但此種設計方法不適用于試驗因素和水平較多的試驗，因處理太多而導致工作量過大。采用正交試驗設計的也很多，如在丹參愈傷組織誘導的培養基優化的過程中［5］。在山豆根組織培養激素優化過程中［6］。但這種方法同樣需要重復試驗，得到的結論也都是設計好的一些因素的點的組合，相對來說還是不夠精確。而本試驗中采用的二次正交旋轉組合設計具有試驗次數少、計算簡便，并且能根據預測值直接尋求最優區域的優點，因此得到結果更加精確。利用這種設計方法進行培養基優化的也有相關的報道，如在甘草［7］、大豆［8］愈傷組織增殖培養過程中。本試驗通過響應面優化出的最佳培養基為MS+6-BA 1.169 mg/L+NAA 1.118 mg/L+2，4-D1.130 mg/L，與柳福智［9］的研究結果NAA 1.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L+ 6-BA 1.0 mg/L相近，但較其更為精確。

圖2　懸浮細胞Fig.2　Suspension cells

［1］ 徐任生.丹參-生物學及應用［M］.北京:科學出版社，1990: 158-184. XU Rensheng.Biology and Application of Saliae Miltiorrhiza Bge［M］.Beijing:Science Press，1990:158-184.

［2］LIU Jin，SHEN Hanming，ONG CHOON-NAM.Salvia Miltiorrhiza inhibits cell growth and induces Apoptosis in human Hepatoma Hepatoma HepG2 cells［J］.Canc Lett，2000，153（1-2）:85-93.

［3］王麗艷，荊瑞勇，譚煥波，等.旱半夏組織培養條件的優化研究［J］.時珍國醫國藥，2008，19（7）:1795-1796. WANG Liyan，JING Ruiyong，TAN Huanbo，et al.Optimization of tissue culture condition on Pinellia tenata（Thumb）Breit［J］. LISHIZHEN Medicine and Material Mediaca Research，2008，19（7）:1795-1796.

［4］王麗艷，荊瑞勇，郭培磊.薺菜無菌快速繁殖技術的研究［J］.黑龍江八一農墾大學學報，2007，19（3）:13-16. WANG Liyan，JING Ruiyong，GUO Peilei.Study on rapid propagation technology of Capsella bursa-pastoris［J］.Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University，2007，19（3）:13-16.

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［6］李林軒，韋坤華，唐美瓊，等.正交試驗優化山豆根組織培養條件［J］.中藥材，2012，35（4）:514-517. LI Linxuan，WEI Shenhua，TANG Meiqiong，et al.Optimization of tissue culture of Sophora tonkinensis Gagnep by orthogonality design［J］.Journal of Chinese Medicinal Materials，2012，35（4）: 514-517.

［7］王麗艷，荊瑞勇，殷奎德.甘草愈傷組織繼代培養中激素濃度組合的優化研究［J］.激光生物學報，2010，19（6）:848-852，842. WANG Liyan，JING Ruiyong，YIN Kuide.Optimum combination of hormone concentration during callus subculture of Glycyrrhiza uralensis［J］.Acta laser Biology Sinica，2010，19（6）:848-852，842.

［8］王麗艷，荊瑞勇，郭永霞，等.大豆愈傷組織繼代培養中激素濃度組合的優化研究［J］.中國油料作物學報，2013，35（4）: 446-450. WANG Liyan，JING Ruiyong，GUO Yongxia，et al.Study on optimum hormone concentration during subculture of soybean callus tissue［J］.Chinese Journal of Oil Crop Sciencer，2013，35（4）: 446-450.

［9］柳福智.丹參愈傷組織誘導與有效成分含量的研究［D］.陜西:西北農林科技大學，2006. LIU Fuzhi.Induction of callus tissue of Saliae miltiorrhiza Bge and content of effective elements［D］.Shanxi:Northwest Agriculture& Forestry University，2006.

Study on Optimization of Hormone Concentration in Callus Culture of Saliae Miltiorrhiza Bge

JING Ruiyong，WANG Liyan，GUO Yongxia*
（Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing163319，Heilongjiang，China）

Objective:To seek optimum combination of hormone concentration during callus subculture of Glycyrrhiza uralensis.Methods:The seed of Saliae Miltiorrhiza Bge as explants，first generation callus induced by embryo root and hypocotyledonary axis of sterilized seed as material，the net fresh weight of callus as indicator，mathematical model were established by quadratic orthogonal rotary composite experimental design.The concentration of hormones were optimized by method of response surface.Result:The optimum combination of hormone concentration during callus subculture of Saliae Miltiorrhiza Bge is 6-BA 1.514 mg/L，NAA 2.059 mg/L，2，4-D 2.137 mg/L.The net fresh weight of callus is 35.66g.

Saliae Miltiorrhiza Bge；method of response surface；callus；hormone concentration

S567.1

A

1007-7146（2015）04-0377-05

2014-12-09；

2015-02-03

黑龍江省自然科學基金（QC2012C049）

荊瑞勇（1978-），男，內蒙人，博士后，講師，主要從事生物技術方面研究。（電話）0459-6819299-810；（電子信箱）jry_2002@126.com

郭永霞（1970-），女，黑龍江人，博導，教授，主要從事生物技術方面研究。（電話）+86-459-6813789；（電子信箱）gyxia@163.com