桃核承氣湯對(duì)膿毒癥大鼠凝血-炎癥水平的調(diào)控作用研究*

★　黎永琳　　周紅　　鮑丹艷　劉云濤　李際強(qiáng)　　（.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院　廣州50405；.廣東省中醫(yī)院、廣東省中醫(yī)急癥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　廣州500；.廣東祈福醫(yī)院　廣州5495）

桃核承氣湯對(duì)膿毒癥大鼠凝血-炎癥水平的調(diào)控作用研究*

★黎永琳1周紅2**鮑丹艷3劉云濤2李際強(qiáng)2（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院廣州510405；2.廣東省中醫(yī)院、廣東省中醫(yī)急癥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣州510120；3.廣東祈福醫(yī)院廣州511495）

目的：觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體（EPCR）對(duì)膿毒癥大鼠凝血相關(guān)因子血清凝血因子X(jué)IV（FXIV）活性及炎癥相關(guān)因子血清白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平的影響以及桃核承氣湯對(duì)凝血-炎癥系統(tǒng)的調(diào)控作用。方法：將大鼠分為正常組、模型組（膿毒癥）、中藥組（造膿毒癥模型后用桃核承氣湯治療），采用二次打擊法建立膿毒癥模型，ELISA法檢測(cè)造模后休克開(kāi)始及復(fù)蘇后第72h血清EPCR的表達(dá)以及FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，第120h各組IL-6、TNF-α的含量。結(jié)果：膿毒癥大鼠的EPCR水平，中藥組與正常組、模型組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而凝血因子FXIV、IL-1β含量中藥組與正常組、模型組之間未見(jiàn)差異（P＞0.05）。膿毒癥大鼠造模后TNF-α水平，在第72h時(shí)中藥組（2.14± 0.55）和正常組（2.04±0.52）與模型組（2.75±0.83）含量有明顯差異（P＜0.05），第120h時(shí)中藥組（3.13±0.52）和正常組（2.77±0.3）低于模型組（3.56±0.56）水平（P＜0.05），且三組TNF-α含量均高于第72h時(shí)。結(jié)論：桃核承氣湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)膿毒癥大鼠EPCR水平的表達(dá)，抑制TNF-α水平，從而調(diào)控膿毒癥的炎癥反應(yīng)。在膿毒癥的凝血-炎癥網(wǎng)絡(luò)中桃核承氣湯的調(diào)節(jié)凝血作用或弱于調(diào)節(jié)炎癥作用。

EPCR；TNF-α；凝血因子FXIV；中藥治療；二次打擊法

膿毒癥（sepsis）是感染、創(chuàng)傷和燒傷等多種臨床危重癥的嚴(yán)重合并癥。膿毒癥不僅表現(xiàn)有失控的炎癥反應(yīng)，而且存在凝血、免疫、細(xì)胞增殖等活性的改變，是多系統(tǒng)環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果。蛋白C（PC）抗凝系統(tǒng)不僅具有抗凝活性，而且調(diào)整著機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)功能，膿毒癥中PC抗凝活性的下調(diào)促進(jìn)了膿毒癥病理過(guò)程的進(jìn)展。血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體（EPCR）是蛋白C抗凝系統(tǒng)主要成分之一。EPCR在膿毒癥中亦介導(dǎo)了活化蛋白C（APC）抗炎及細(xì)胞保護(hù)作用的發(fā)揮。因此，對(duì)促進(jìn)嚴(yán)重感染性疾病的治療，應(yīng)基于對(duì)治療方式有效評(píng)價(jià)和分子水平，對(duì)凝血-炎癥系統(tǒng)間潛在交互反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行深入了解。本研究用桃核承氣湯治療膿毒癥大鼠，從EPCR表達(dá)、凝血因子X(jué)IV（FXIV）及炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6水平入手，揭示膿毒癥凝血和炎癥形成網(wǎng)絡(luò)并相互促進(jìn)，內(nèi)皮細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)樞紐作用的病理生理學(xué)機(jī)制，從而為膿毒癥的中西醫(yī)結(jié)合防治提供新的切入點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物及分組選用SPF級(jí)雄性SD大鼠90只，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重200～220g，隨機(jī)分為正常組、模型組、桃核承氣湯中藥組3組，各組分別為30只。

1.2儀器與試劑高速冷凍離心機(jī)（上海科學(xué)儀器廠），標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀（上海將來(lái)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（昆山東旺精密儀器有限公司）。血清EPCR、FXIV、IL-1β（CSB-E08055r）、IL-6 （CSB-E04640r）、TNF-α（CSB-E11987r）ELISA試劑盒，美國(guó)CUSABIO公司生產(chǎn)。

1.3桃核承氣湯制備每劑中藥煎劑由桃仁12g、大黃12g、桂枝6g、芒硝6g、甘草6g組成，所有藥物由廣東省中醫(yī)藥中藥房提供。上述藥物加水100mL，頭煎20min，二煎加水100mL煎煮30min，分別濾取藥液，合并兩次藥液，在60℃恒溫條件下濃縮成每mL含生藥1g的藥液備用。水煎劑由廣東省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室臨床藥理室制備。生大黃于濃縮后期放入。

1.4模型制作與取材采用改良的“二次打擊法”復(fù)制大鼠膿毒癥模型［1］。正常組：正常飼養(yǎng)，不做手術(shù)處理，只行置管抽血備測(cè)，不行失血及液體復(fù)蘇處置。模型組：采用改良的“二次打擊法”復(fù)制膿毒癥大鼠模型，造模成功后，每隔1h腹腔注射5%葡萄糖鹽水（20mL/kg），作為支持治療，大鼠成活大于24h則可抽血待查。中藥組造模手術(shù)同模型組，于第一次“失血性休克-復(fù)蘇”打擊后開(kāi)始經(jīng)胃管灌注桃核承氣湯2mL/kg（分別灌藥0.40～0.42mL），1次/8h。在24h前死亡者視為復(fù)蘇失敗，不取樣品及檢測(cè)。造模成功后，各組在造模第3天后，將剩下存活的一半大鼠，從大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈采血1.8mL，全血標(biāo)本于室溫放置2h后于1000xg離心20min，取上清檢測(cè)EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α；另一半大鼠在造模后第5天進(jìn)行同樣的操作后，檢測(cè)IL-6、TNF-α。

1.5大鼠血清EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α含量檢測(cè)采用定量夾心酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA），分別測(cè)定大鼠血清EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。通過(guò)用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)定每孔的光密度值（OD值），在加終止液后15min內(nèi)進(jìn)行血清EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后計(jì)算出大鼠血清EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)采用SPSS18.0軟件進(jìn)行分析，F(xiàn)XIV、EPCR、IL-1β、IL-6、TNF-α水平用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。FXIV、EPCR、IL-1β、IL-6、TNF-α各組間比較采用單因素方差分析，如方差不齊的，采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)換后再采用單因素方差分析檢驗(yàn)。各組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。兩個(gè)獨(dú)立樣本的比較符合方差齊性者來(lái)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合者采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有顯著性。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠血清EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較見(jiàn)表1。三組間凝血因子FXIV、IL-1β含量未見(jiàn)差異（P＞0.05），而EPCR水平互相不一致（P＜0.05），TNF-α水平在第3天時(shí)正常組與中藥組相近（P＞0.05），模型組與正常組、中藥組含量均不一致（P＜0.05）。

2.2各組血清IL-6、TNF-α在第72h、120h的水平比較見(jiàn)表1。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)比了正常組、模型組、中藥組在第72h、第120h時(shí)IL-6、TNF-α水平的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第72h、120h，各組血清中IL-6的水平無(wú)差異（P＞0.05），但在第72h時(shí)，中藥組＞正常組＞模型組，第120h時(shí)，正常組＞中藥組＞模型組；而TNF-α的水平則不一致（P＜0.05），第120h時(shí)，各組TNF-α水平均高于第72h時(shí)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，模型組TNF-α水平均高于正常組、中藥組。

表1　血清EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α含量一覽表

3　討論

3.1EPCR或能抑制膿毒癥炎癥反應(yīng)水平EPCR是蛋白C（PC，抗凝系統(tǒng)組成部分）或活化蛋白C （APC）的受體，PC或APC通過(guò)結(jié)合EPCR后，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，或進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮抗凝、抗炎作用。依據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，EPCR、FXIV的水平在正常組大鼠與模型組大鼠之間無(wú)差異。我們通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，盡管都是在膿毒癥的模型中，膿毒癥組EPCR蛋白的水平和對(duì)照組相比，得到的結(jié)果不完全一致，有的研究［2-3］發(fā)現(xiàn)，膿毒癥組的EPCR蛋白水平較對(duì)照組下降，有的研究［4］卻是發(fā)現(xiàn)EPCR蛋白水平較正常組代償性增加。而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，EPCR水平中藥組高于正常組，模型組最低。對(duì)此我們發(fā)現(xiàn)，以上研究在檢測(cè)EPCR蛋白水平時(shí)存在一個(gè)檢測(cè)時(shí)間、實(shí)驗(yàn)對(duì)象的差異，前者是采用膿毒癥細(xì)胞，在24h、48h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定的，后者是采用盲腸結(jié)扎-穿孔建立的膿毒癥動(dòng)物模型上，在22h時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行測(cè)定。反觀我們的實(shí)驗(yàn)則是在72h后進(jìn)行EPCR蛋白水平的測(cè)定。針對(duì)以上情況，我們猜想：EPCR蛋白水平可能隨著機(jī)體反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短在體內(nèi)有一個(gè)波動(dòng)的情況，在早期以EPCR代償性增加為主，中期則以下降為主，并逐漸恢復(fù)相對(duì)正常水平。為此，我們將可以進(jìn)一步細(xì)化我們的實(shí)驗(yàn)，并對(duì)膿毒癥不同時(shí)間段EPCR蛋白水平的檢測(cè)和觀察使用了桃核承氣湯干預(yù)后的EPCR蛋白水平表達(dá)的動(dòng)態(tài)演變。

3.2通腑活血法能下調(diào)機(jī)體膿毒癥的炎癥反應(yīng)水平中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，膿毒癥為邪毒入侵（嚴(yán)重感染）導(dǎo)致熱毒熾盛，毒熱入血，血熱互結(jié)，敗血阻滯，瘀血產(chǎn)生，毒瘀并存，最終致出血、休克、昏迷。通腑瀉下、活血化瘀是治療膿毒癥的重要措施。腸道是膿毒癥啟動(dòng)器官，通腑瀉下法多以中藥大黃單味或以大承氣湯為主治療內(nèi)毒素所致腸源性感染。認(rèn)為外邪與腸中糟粕搏結(jié)，腑氣不通，胃腸道內(nèi)G-過(guò)度繁殖，菌群比例失調(diào)，毒力劇增，是導(dǎo)致腸源性?xún)?nèi)毒素血癥的主要病機(jī)。故采用通腑瀉下法可以蕩滌積滯，抑制過(guò)度發(fā)酵，解除腸道組織缺血缺氧狀態(tài)，恢復(fù)腸粘膜屏障功能，阻止腸道細(xì)菌移位，避免腸源性?xún)?nèi)毒素的吸收［5-7］。在本次實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，中藥組的TNF-α水平比模型組的降低，而3組IL-6的水平是相近的，這提示我們桃核承氣湯有可能通過(guò)下調(diào)機(jī)體TNF-α水平的表達(dá)，以抑制膿毒癥炎癥水平，達(dá)到保護(hù)機(jī)體的作用。

3.3桃核承氣湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體EPCR的表達(dá)，以抑制TNF-α的含量，來(lái)達(dá)到降低膿毒癥炎癥的反應(yīng)水平本次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)，在正常組、模型組、中藥組EPCR表達(dá)水平變化的同時(shí)，TNF-α的水平也在變化。這提示我們EPCR表達(dá)水平與TNF-α水平可能相關(guān)。陳友琴等［8］的研究給了我們一個(gè)啟示，APC能顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞因子（IL-1α和IL-8）分泌和黏附分子（ICAM-1，VCAM-1 and E-selction）表達(dá)，從而通過(guò)抑制炎癥因子的產(chǎn)生來(lái)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。而EPCR作為APC的受體，APC通過(guò)與EPCR結(jié)合，從而發(fā)揮抑制TNF-α的作用，并通過(guò)下級(jí)的調(diào)控反應(yīng)抑制膿毒癥炎癥的進(jìn)程。而桃核承氣湯能夠通過(guò)調(diào)節(jié)膿毒癥大鼠EPCR水平的表達(dá)，從而起到調(diào)控炎癥的作用。

3.4桃核承氣湯或存在調(diào)節(jié)膿毒癥大鼠凝血功能的作用盡管本次實(shí)驗(yàn)中3組大鼠凝血因子FXIV的表達(dá)沒(méi)有差異，但楊榮源等［9］的研究發(fā)現(xiàn)，通腑活血法能調(diào)節(jié)膿毒癥凝血功能。這可能是因?yàn)槲覀儽敬螌?shí)驗(yàn)選用的反映凝血功能水平的指標(biāo)不大合適。因此我們下一步的實(shí)驗(yàn)可以選取不同的凝血指標(biāo)，在不同時(shí)間段，使用桃核承氣湯進(jìn)行干預(yù)，以驗(yàn)證臨床發(fā)現(xiàn)，從而為揭示凝血-炎癥網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)機(jī)制提供切入點(diǎn)。

［1］姚詠明，盛志勇.膿毒癥防治學(xué)［M］.北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2008.

［2］李云峰，蔡業(yè)平，張圣岸，等.低分子肝素對(duì)膿毒癥大鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體和蛋白酶活化受體1表達(dá)的影響［J］.中國(guó)醫(yī)師雜志，2011，13（5）：621-623.

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R278

A

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B061200038）。

**通信作者：周紅（1960-），女，主任醫(yī)師，教授。Email：zhouhong282@126.com。

（2014-10-10）編輯：萬(wàn)崇毅